Id-1基因沉默抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌生長轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、研究目的:
　　 1.研究分化抑制因子Id-1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義,初步探討Id-1在口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、侵襲、血管新生以及淋巴新生的作用。
　　 2.探討慢病毒介導(dǎo)的RNAi對舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞中Id-1基因沉默后對細(xì)胞增殖、侵襲以及VEGF-C表達(dá)的影響。
　　 3.探討裸鼠舌癌原位移植瘤瘤內(nèi)注射Id-1-siRNA-慢病毒顆粒對移植瘤生長以及淋巴新生的影響,并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

2、r>　　 4.探討以Id-1基因作為靶基因抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌生長及淋巴轉(zhuǎn)移的可行性。
　　 研究方法:
　　 1.37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)三種口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113舌鱗癌細(xì)胞、SAS舌癌細(xì)胞以及Bucca1885頰癌細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞達(dá)80～90％融合時,提取三種細(xì)胞的總RNA和總蛋白。應(yīng)用RT-PCR方法檢測三種細(xì)胞內(nèi)Id-1mRNA的表達(dá),應(yīng)用Western-blot方法檢測三種細(xì)胞內(nèi)Id-1蛋白的表達(dá)。將

3、培養(yǎng)的癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片處理,通過細(xì)胞免疫組化方法檢測Id-1蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)及蛋白定位。
　　 2.收集2005～2008年山東大學(xué)齊魯醫(yī)院口腔頜面外科128例口腔鱗狀細(xì)胞癌住院患者的腫瘤標(biāo)本。128例患者按照年齡、性別、是否吸煙、是否飲酒、腫瘤發(fā)病部位、腫瘤大小、腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度、腫瘤有無淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤有無復(fù)發(fā)分類。所有患者術(shù)前均未行放療、化療以及其它干預(yù)治療,并同期行頸淋巴清掃術(shù)。提取腫瘤標(biāo)本的總

4、RNA和總蛋白,應(yīng)用RT-PCR方法檢測腫瘤標(biāo)本內(nèi)Id-1mRNA的表達(dá),應(yīng)用Western-blot方法檢測腫瘤標(biāo)本內(nèi)Id-1蛋白的表達(dá)。制備腫瘤標(biāo)本蠟塊,應(yīng)用免疫組化方法檢測Id-1蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)定位,并對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評分分析,評價Id-1蛋白的表達(dá)與臨床資料之間的關(guān)系。
　　 3.應(yīng)用免疫組化方法檢測Id-1、VEGF-C蛋白在128例口腔鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中的表達(dá),并以抗體CD34、LYVE-1標(biāo)記腫瘤內(nèi)血

5、管和淋巴管。對Id-1、VEGF-C免疫組化結(jié)果進(jìn)行評分分析,測定腫瘤微血管密度及淋巴管密度,評價Id-1蛋白的表達(dá)與血管新生、淋巴新生的關(guān)系。
　　 4.37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞,將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以4×104數(shù)目接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入2ml培養(yǎng)基。48小時后,細(xì)胞融合率可達(dá)到30～50％。將細(xì)胞分為慢病毒實(shí)驗(yàn)組、慢病毒陰性對照組、ENi.S.空白對照組,分別加入Id-1-RNAi-L

6、entivirus(復(fù)感染指數(shù)MOI值為50)、NC-RFP-Lentivirus(MOI為50)和ENi.S.,37℃、5％CO2孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。
　　 RMA干擾后第五天,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法檢測不同實(shí)驗(yàn)組中Id-1、VEGF-C的基因表達(dá)。RNA干擾后第六天,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用western-blot方法檢測不同實(shí)驗(yàn)組中Id-1、VEGF-C的蛋白表達(dá)。同時收集RNA干擾后第六天

7、細(xì)胞上清液,對分泌至細(xì)胞外的VEGF-C蛋白進(jìn)行ELLISA檢測。分析三個不同實(shí)驗(yàn)組中Tca8113細(xì)胞Id-1和VEGF-C的基因、蛋白表達(dá)情況。觀察Id-1基因沉默后對VEGF-C表達(dá)的影響。
　　 應(yīng)用MTT法檢測Id-1基因沉默后1～7天Tca8113細(xì)胞的生長情況,并繪制細(xì)胞生長曲線,觀察Id-1基因沉默對Tca8113細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 RNA干擾后第六天收集不同實(shí)驗(yàn)組中Tca8113細(xì)胞,重懸于培養(yǎng)

8、液中,使終濃度為2×106/ml,吸取100ul細(xì)胞懸液加Transwell小室中。應(yīng)用Transwell小室方法觀察Id-1基因沉默對Tca8113細(xì)胞侵襲性的影響。
　　 5.裸鼠舌癌腫瘤模型的建立:37℃、5％CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)Tca8113舌鱗癌細(xì)胞,在細(xì)胞生長狀態(tài)良好時配制細(xì)胞懸液,使細(xì)胞濃度達(dá)到2×106個/ml,備用。4周齡的BALB/c nu/nu雄性裸鼠,乙醚吸入麻醉后,注射0.1ml Tca8113細(xì)胞懸液

9、(細(xì)胞數(shù)量為2×105個)于裸鼠的舌側(cè)緣粘膜下。接種腫瘤細(xì)胞后,將裸鼠置于SPF飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),每天觀察裸鼠舌部粘膜的成瘤情況。
　　 6.當(dāng)裸鼠舌側(cè)緣形成的腫瘤直徑約3～5mm大小時,選擇生存狀態(tài)良好的成瘤裸鼠21只,隨機(jī)分成慢病毒干擾實(shí)驗(yàn)組、慢病毒陰性對照組、ENi.S.空白對照組3個組,每組7只。分別抽取0.1ml Id-1-RNAi慢病毒顆粒溶液(MOI值為50)、RFP慢病毒顆粒溶液(MOI值為50)和ENi.S。在裸

10、鼠舌體腫瘤內(nèi)行多點(diǎn)注射,每周注射兩次,連續(xù)注射兩周。每天觀察腫瘤生長情況,3天測量一次腫瘤直徑,計(jì)算腫瘤體積,探討腫瘤內(nèi)注射Id-1-siRNA-慢病毒顆粒后對裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 三周后脫頸處死三組裸鼠,收集腫瘤標(biāo)本。將收集的裸鼠腫瘤部分提取RNA,檢測瘤內(nèi)注射Id-1-siRNA-慢病毒顆粒對Id-1、VEGF-C基因表達(dá)的影響。部分標(biāo)本制備蠟塊,以Id-1、VEGF-C、Ki67、LYVE-1為抗體,應(yīng)用免疫組化方

11、法檢測三組裸鼠腫瘤標(biāo)本中Id-1、VEGF-C、Ki67的表達(dá)及淋巴管密度,研究Id-1基因沉默后對裸鼠移植瘤增殖及淋巴新生的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.三種口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中Id-1mRNA以及蛋白均存在過表達(dá),免疫組化結(jié)果顯示Id-1蛋白既位于細(xì)胞漿也位于細(xì)胞核。
　　 2.在口腔正常粘膜組織中,Id-1表達(dá)陰性或者呈弱表達(dá),而在口腔鱗狀細(xì)胞癌中,大部分存在過表達(dá),128例腫瘤組織的免疫組化顯示Id-1

12、陽性表達(dá)率為64.8％。Id-1蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙、飲酒、腫瘤生長部位、腫瘤分化程度均無關(guān),而與患者腫瘤的大小、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤有無復(fù)發(fā)有關(guān)。在直徑大于31mm的腫瘤組織中Id-1蛋白的表達(dá)比小于31mm的腫瘤表達(dá)強(qiáng)(3.35±1.907vs4.06±2.017,p=0.013)；Ⅲ、Ⅳ期的患者腫瘤組織中Id-1蛋白的表達(dá)比Ⅰ、Ⅱ期相對強(qiáng)(4.19±1.875vs3.31±2.054,p=0.031)；在存在淋巴

13、轉(zhuǎn)移的患者組織標(biāo)本中,Id-1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度相對強(qiáng)(4.37±1.788vs3.26±2.048,p=0.001)；腫瘤復(fù)發(fā)的患者其表達(dá)強(qiáng)度亦高(4.57±2.03vs3.46±1.96,p=0.003)。
　　 3.對128例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中Id-1的表達(dá)情況與微血管密度、VEGF-C的表達(dá)以及癌周淋巴管密度進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Id-1的表達(dá)與微血管密度、VEGF-C的表達(dá)以及癌周淋巴管密度呈正相關(guān)(r

14、=0.223、0.569、0.240,p=0.011、0.000、0.006)。不同Id-1表達(dá)強(qiáng)度之間MVD的表達(dá)存在差異,在Id-1中等和強(qiáng)表達(dá)的標(biāo)本中,其MVD明顯高于無Id-1表達(dá)和Id-1弱表達(dá)的標(biāo)本(40.15±7.72 vs37.14±6.37,p=0.027)；在Id-1弱表達(dá)的組別中,VEGF-C的表達(dá)相對較低(1.87±1.30vs3.08±0.76.p=0.000),癌周淋巴管密度也相對較低(13.21±5.53v

15、s16.06±6.16,p=0.012)。
　　 4.應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的Id-1-siRNA對Tca8113細(xì)胞進(jìn)行Id-1基因沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)后第五天RNA干擾組Id-1基因表達(dá)明顯降低,與對照組相比有顯著性差異(p<0.01)；實(shí)驗(yàn)后第六天RNA干擾組Id-1蛋白表達(dá)明顯降低,與對照組相比有顯著性差異(p<0.01)。Id-1基因沉默后Tca8113細(xì)胞的VEGF-C基因表達(dá)明顯降低(p<0.01)；Western-blo

16、t和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)VEGF-c的蛋白表達(dá)也明顯降低(p<0.01)。
　　 應(yīng)用MTT法檢測Id-1基因沉默后Tca8113細(xì)胞增殖活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干擾實(shí)驗(yàn)后的前三天,三組Tca8113細(xì)胞的增殖活性未見明顯差異,第四天開始,干擾組細(xì)胞的增殖活性與兩對照組相比出現(xiàn)降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(4、5、6、7天p=0.036,0.004,0.001,0.002)。
　　 應(yīng)用Transwell小室方法觀察Id-1基因沉默