基于多色熒光檢測(cè)的微流控裝置同時(shí)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化小分子物種(H2O2，Cys和GSH)研究.pdf

1、細(xì)胞的生命過(guò)程需要氧化、抗氧化小分子的協(xié)同參與，為了發(fā)現(xiàn)以往在細(xì)胞群體研究中因統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)而被掩蓋或無(wú)法發(fā)現(xiàn)的生理機(jī)制，進(jìn)一步研究生理病理過(guò)程，需要準(zhǔn)確獲取單細(xì)胞內(nèi)這些小分子的種類(lèi)和含量信息。但是，由于細(xì)胞體積小，細(xì)胞內(nèi)許多目標(biāo)小分子不僅濃度低、濃度差異大，而且反應(yīng)活性高、可以相互轉(zhuǎn)化、相互影響、無(wú)法擴(kuò)增等條件的限制，目前商品化儀器難以準(zhǔn)確定量單細(xì)胞內(nèi)這些小分子物種的含量，導(dǎo)致一些分析問(wèn)題至今尚無(wú)解決良策。比如，過(guò)氧化氫(H2O2)是細(xì)胞

2、內(nèi)重要的氧化小分子，而谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸（Cys）則是細(xì)胞中具有代表性的重要抗氧化小分子，它們的生理濃度水平與生物體的氧化還原平衡息息相關(guān)，并在一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。由于缺乏在單細(xì)胞水平上對(duì)它們同時(shí)測(cè)定的分析方法，目前還難以揭示這些小分子的氧化、還原損傷與降解機(jī)制，所以需要發(fā)展同時(shí)定量測(cè)定單細(xì)胞內(nèi)H2O2、GSH和Cys的分析方法和相應(yīng)儀器。微流控芯片作為一類(lèi)以在微米尺度空間精確操控與平行化處理皮升到微升級(jí)

3、液體為特征的新興分析技術(shù)，因具有二維或三維通道結(jié)構(gòu)、通道尺寸與細(xì)胞尺度相當(dāng)、分析速度快、樣品和試劑消耗少、易于集成化等優(yōu)點(diǎn)，日漸成為單細(xì)胞研究的重要技術(shù)平臺(tái)。檢測(cè)器作為微流控芯片分析系統(tǒng)的重要組成，用來(lái)確定微流控芯片處理或分離的分析物的組成及含量。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)因具有靈敏度高、適合超微體積樣品測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，而成為微流控芯片分析中常用的檢測(cè)手段。特別是高靈敏激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器與具有高效化學(xué)分離特征的微流控芯片電泳的聯(lián)用，可以用于單細(xì)胞組分

4、分析，由此產(chǎn)生的方法和儀器具有低耗、快速、多組分高效分離、可定量和易于自動(dòng)化整合等優(yōu)勢(shì)。但是，在對(duì)單細(xì)胞內(nèi)這些多組分小分子進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)時(shí)，由于單細(xì)胞樣品往往需要不同染料或探針的多重標(biāo)記，使得這些分子的熒光特性各異，而現(xiàn)有的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器多是基于“單一波長(zhǎng)激光激發(fā)、單色熒光檢測(cè)”，難以同時(shí)檢測(cè)與定量分析這些具有“不同激發(fā)、不同發(fā)射”多色熒光標(biāo)記的多組分小分子。
　　本研究分為三個(gè)部分：第一章緒論，首先簡(jiǎn)單介紹了同時(shí)測(cè)定單細(xì)胞內(nèi)氧

5、化、抗氧化小分子物種的意義，目前常用檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化、抗氧化小分子物種的方法。然后介紹了微流控芯片電泳及其檢測(cè)技術(shù)，以及微流控芯片電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)單細(xì)胞內(nèi)氧化、抗氧化小分子物種的研究進(jìn)展。第二章針對(duì)目前微流控芯片電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)不適應(yīng)“不同激發(fā)、不同發(fā)射”多組分小分子同時(shí)檢測(cè)等問(wèn)題，搭建了一種微流控多色熒光檢測(cè)裝置。該裝置具有可見(jiàn)、近紅外兩種波長(zhǎng)激光同時(shí)激發(fā)，綠色、紅色和近紅外三色熒光同步檢測(cè)，以及激光對(duì)焦等功能，便于實(shí)現(xiàn)單細(xì)

6、胞內(nèi)“不同激發(fā)、不同發(fā)射”多組分小分子的在線、高靈敏同時(shí)檢測(cè)，有助于拓展微流控芯片電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)在單細(xì)胞組分分析等領(lǐng)域的應(yīng)用空間。第三章利用搭建的微流控多色熒光檢測(cè)裝置，結(jié)合液壓-電動(dòng)門(mén)式進(jìn)樣方法及實(shí)驗(yàn)室合成的熒光探針 FS、Cy-3-NO2，發(fā)展了一種在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞進(jìn)樣、溶膜、電泳分離和單個(gè)小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)H2O2、Cys和GSH同時(shí)定量檢測(cè)的新方法。利用所建方法，研究了不同濃度的酒精刺激及水飛薊素保護(hù)條件下，100