蛋白質提取與制備的原理和方法

1、蛋白質提取與制備的原理和方法蛋白質提取與制備的原理和方法蛋白質提取與制備蛋白質種類很多，性質上的差異很大，既或是同類蛋白質，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個固定的程序適用各類蛋白質的分離。但多數(shù)分離工作中的關鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結合的蛋白質溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質和酶。蛋白質與酶在不

2、同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水基團的比例，其次取決于這些基團的排列和偶極矩。故分子結構性質是不同蛋白質溶解差異的內因。溫度、pH、離子強度等是影響蛋白質溶解度的外界條件。提取蛋白質時常根據(jù)這些內外因素綜合加以利用。將細胞內蛋白質提取出來。并與其它不需要的物質分開。但動物材料中的蛋白質有些可溶性的形式存在于體液（如血漿、消化硫等）中，可以不必經(jīng)過提取直接進行分離。蛋白質中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋

3、白質，只需要適當?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質，最后剩下的就是不溶性蛋白質。這些蛋白質經(jīng)細胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當溶劑，將蛋白質溶解出來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。水適用于白蛋白類蛋白質的抽提。如果抽提物的pH用適當緩沖液控制時，共穩(wěn)定性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂苷（Digitonin）溶液或有機溶劑來抽提。其它不溶于

4、水的蛋白質通常用稀堿溶液抽提。蛋白質類別和溶解性質白蛋白和球蛋白:溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可被50%飽和度硫酸銨析出。真球蛋白:一般在等電點時不溶于水，但加入少量的鹽、酸、堿則可溶解。擬球蛋白:溶于水，可為50%飽和度硫酸銨析出醇溶蛋白:溶于70～80%乙醇中，不溶于水及無水乙醇殼蛋白:在等電點不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸、稀堿溶液精蛋白:溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀組蛋白:溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白質:不溶于

5、水、鹽、稀酸及稀堿綴合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白和氮苯蛋白等):此類蛋白質溶解性質隨蛋白質與非蛋白質結合部分的不同而異，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，則脂溶性占優(yōu)勢，如脂肪部分被包圍于分子之中，則水溶性占優(yōu)勢。蛋白質的制備是一項十分細致的工作。涉及物理學、化學和生物學的知識很廣。近年來雖然有了不改進，但其主要原理仍不外乎兩個方面：致活性喪失。因此選

6、擇的條件應為十分溫和。同時應注意防止系統(tǒng)中重金屬離子、細胞自身酶系及其他有毒物質的污染。蛋白質提取與制備的注意事宜蛋白質提取與制備的注意事宜:一、原料的選擇早年為了研究的方便，盡量尋找含某種蛋白質豐富的器官從中提取蛋白質。但至目前經(jīng)常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細胞膜或內膜等原材料，因而對提取要求更復雜一些。原料的選擇主要依據(jù)實驗目的定。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。盡量要新鮮原

7、料。但有時這幾方面不同時具備。含量豐富但來源困難，或含量來源均理想，但分離純化操作繁瑣，反而不如含量略低些易于獲得純品者。一般要注意種屬的關系，如鰹的心肌細胞色素C較馬的易結晶，馬的血紅蛋白較牛的易結晶。要事前調查制備的難易情況。若利用蛋白質的活性，對原料的種屬應幾乎無影響。如利用胰蛋白酶水解蛋白質的活性，用豬或牛胰臟均可。但若研究蛋白質自身的性質及結構時，原料的來源種屬必須一定。研究由于病態(tài)引起的特殊蛋白質（本斯.瓊斯氏蛋白、貧血血紅

8、蛋白）時，不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個體的原料。可能時盡量用全年均可采到的原料。對動物生理狀態(tài)間的差異（如饑餓時脂肪和糖類相對減少），采收期及產(chǎn)地等因素也要注意。二、前處理1、細胞的破碎材料選定通常要進行處理。要剔除結締組織及脂肪組織。如不能立即進行實驗，則應冷凍保存。除了提取及胞細外成分，對細胞內及多細胞生物組織中的蛋白質的分離提取均須先將細胞破碎，使其充分釋放到溶液中。不同生物體或同一生物體不同的組織，其細胞破壞難易不一

9、，使用方法也不完全相同。如動物胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預先絞碎再制成勻槳。⑴機械方法主要通過機械切力的作用使組織細胞破壞。常用器械有：①高速組織搗碎機（轉速可達10000rpm，具高速轉動的鋒利的刀片），宜用于動物內臟組織的破碎；②玻璃勻漿器（用兩個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對細胞破碎程度較高速搗碎機高，機械切力對分子破壞

10、較小。小量的也可用乳缽與適當?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細。但在磨細時局部往往生熱導致變性或pH顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時。磨細劑的吸附也可導致?lián)p失。⑵物理方法主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法。Ⅰ反復凍融法于冷藏庫或干冰反復于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結合水凍結產(chǎn)生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘