純化細胞的方法

1、細胞純化,,細胞純化方法分類,自然純化人工純化,,自然純化即利用某一種類細胞的增殖優(yōu)勢，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細胞，最后留下生長優(yōu)勢旺的細胞，達到細胞純化的目的。留下的細胞：成纖維細胞、突變細胞、腫瘤細胞 缺點：（1）無法按需要和實驗目的選擇細胞（2）花費時間長,一、自然純化,1、細胞因子依賴純化法,是通過加入某些特殊的細胞因子而純化出只依賴于這種細胞因子生長的細胞系.人和動物組織中某些細胞需

2、要有特殊的細胞因子存在的環(huán)境才能長期存活和生長繁殖,如白細胞介素-2（IL-2）SHI 他細胞生長所必須的細胞因子,B細胞生長因子是B細胞的生長因子,體外培養(yǎng)中淋巴細胞若加入IL-2就可使T細胞生長繁殖,形成IL-2依賴的T細胞,如CTLL-2細胞系,而其他細胞則自然被淘汰,采用此法還建立了IL-6依賴的細胞系,如B9、CTD7細胞系.,二、人工純化,人工純化是利用人為手段造成對某一細胞生長有利的環(huán)境條件,抑制其他細胞的生長從而達到純化

3、細胞的目的.主要有以下6種方法.1.細胞因子依賴純化法2.酶消化法3.機械刮除法 4.反復貼壁法5.離心分離法 1、速度沉降分離法 2、等密度梯度沉降分離法6.單細胞克隆培養(yǎng),2、酶消化法：,酶消化法是比較常用的純化方法,不僅對貼壁細胞可行,能利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同,是兩者分開,達到純化的目的；另外對貼壁細胞與半貼壁細胞及黏附細胞間的分離純化也是十分有效的.,上皮細胞與成纖維細胞的分離純化

4、：,兩者在胰蛋白酶的作用下,由于成纖維細胞先脫壁,二上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁,特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯,故可采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開,方法步驟如下. 采用常規(guī)消化傳代方式將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內兩次,每次加1ml（25ml培養(yǎng)瓶）,來回輕搖1-2次,使胰蛋白酶流過所有細胞表面,然后倒掉. 蓋好瓶塞,將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)成纖維細胞變園,部分脫落

5、,立即加入2ml有血清的培養(yǎng)基終止消化. 用彎頭吸管輕輕吹打成纖維細胞生長區(qū)域（可事先在鏡下用記號筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號）.吹打時不要用力,也不要吹打上皮細胞生長區(qū)域.吹打結束后,再用少量培養(yǎng)基漂洗一遍,然后加入適量培養(yǎng)基于瓶內繼續(xù)培養(yǎng),也可重復上述操作再進行一次. 隔幾日后或下次傳代時,再進行上述操作,進過幾次處理,就可將成纖維細胞去除或者將兩者分開.,3、機械刮除法：,原代培養(yǎng)時,如果上皮細胞和成纖維細胞分為區(qū)成混雜生

6、長,每種細胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上.可采用機械的方法去除不需要的細胞區(qū)域而保留需要的細胞區(qū)域,其方法步驟如下 將要純化細胞的培養(yǎng)瓶,在凈化室內放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進行操作. 用硅橡膠刮子在不需要生長的細胞區(qū)域推劃,使細胞懸浮在培養(yǎng)基中,注意不要傷及所需細胞. 推劃后用培養(yǎng)基沖洗振搖兩次倒掉,即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng), 數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細胞又長出,可再進行上述操作,這樣反復多次可以純

7、化細胞.操作過程中要嚴格無菌操作,防止污染.,4、反復貼壁法：,成纖維細胞與上皮細胞相比,其貼壁過程快,大部分細胞能在短時間內（大約10-30min）完成附著過程（但不一定完全伸展）,而上皮細胞（大部分）在短時間內不能附著或附著不穩(wěn)定,稍加振蕩即浮起,利用此差別可以純化細胞. 將細胞懸液接種在一個培養(yǎng)內（最好培養(yǎng)基內不含血清,此時上皮細胞貼壁更慢）靜置20min. 在倒置顯微鏡下觀察,見部分細胞貼壁,稍加搖動也不浮起時,

8、將細胞懸液導入另一培養(yǎng)瓶中. 繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min,然后重復上述操作后,即可將上皮細胞和成纖維細胞分隔開,在第一瓶和第二瓶以成纖維細胞為主,往后幾瓶即以上皮細胞為主,下次傳代時再按上述方法處理,就可使兩者達到完全分開的目的.,5、電烙篩選法,在貼壁細胞轉化時,往往在培養(yǎng)瓶的細胞層中會出現(xiàn)分散的轉化灶,轉化灶區(qū)域細胞密集、排列規(guī)則,有明顯生長趨勢,與周邊未能轉化的細胞有明顯的區(qū)域界限,此時即可用機械刮除法取出未轉化細胞,也可用電

9、烙篩選法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞. 倒去舊液,并用記號筆劃出轉化灶的區(qū)域. 用加熱的微型電烙器（類似焊接用的電烙鐵）將轉化灶周邊的細胞全部燙死,只保留轉化灶細胞.在單細胞克隆篩選時,也可用此法將單個細胞周圍的細胞殺死. 然后在適應性培養(yǎng)基中（50%是舊液）繼續(xù)培養(yǎng),即可達到純化的目的.,單細胞培養(yǎng)（克隆培養(yǎng)）,有限稀釋法將需要再克隆的細胞株自培養(yǎng)孔內吸出并作細胞計數(shù)，計出1mL的細胞數(shù)。用培養(yǎng)液稀釋， 使細胞

10、濃度為50～60個/mL，于96孔培養(yǎng)板中每孔加0.1mL(五六個細胞/孔)。接種2排，剩余細胞懸液用HT培養(yǎng)液作倍比稀釋，再接種2排，如此類推，直至使每孔含0.5～1個細胞。培養(yǎng)7～10d后，選擇單個克隆生長的陽性孔再一次進行克隆。一般需要如此重復3～5次，直至達100%陽性孔率時即可，以確?？贵w由單個克隆所產生。,,（1）取出抗體陽性孔細胞，用培養(yǎng)液制成細胞懸液。（2）用培養(yǎng)液將細胞稀釋成200個/ml、40個/ml、20個/ml