同步輻射元素成像技術(shù)

1、同步輻射元素成像技術(shù)在環(huán)境科學(xué) 研究中的應(yīng)用,元素成像：樣品內(nèi)元素的空間分布同步輻射：電子運(yùn)動(dòng)的方向發(fā)生變化時(shí)在切線方向產(chǎn)生電磁輻射 1947年, 在電子同步加速器上首次觀察到，命名為 synchrotron radiation,同步輻射的特點(diǎn),高亮度：同步輻射的亮度比最強(qiáng)的X光管特征線亮度強(qiáng)萬(wàn)倍以上。用X光機(jī)拍攝一幅晶體缺陷照片，通常需要7-15天的感光時(shí)間，而利用同步輻射光源只需要幾秒。 寬波譜：覆蓋了紅外

2、、可見(jiàn)、紫外和X光波段。利用單色器可以隨意選擇所需要的波長(zhǎng)，進(jìn)行單色光的實(shí)驗(yàn)。 高準(zhǔn)直：同步輻射的發(fā)射度極小，準(zhǔn)直性可以與激光相媲美。,,BSRF,BSRF：直線加速器200米儲(chǔ)存環(huán)周長(zhǎng)240米，電子能量-2 GeV,,SSRF 儲(chǔ)存環(huán)周長(zhǎng)432米，光子能量為0.1~40 keV ，電子能量3.5GeV,,Spring-8 大儲(chǔ)存環(huán)直徑457米，周長(zhǎng)約1436米，電子能量3.5GeV 。 直線加速器部分長(zhǎng)140米,同步

3、輻射的發(fā)展,第一代同步輻射光源. 在核物理/粒子物理研究的空擋，利用同步加速器所發(fā)射的同步光進(jìn)行科學(xué)研究,稱為寄生方式。北京高能所同步輻射裝置(BSRF) 。 第二代同步輻射光源. 第一代同步輻射光源已不能滿足研究需求，建立了用專(zhuān)門(mén)的裝置產(chǎn)生同步光,例如合肥同步輻射裝置。 第三代同步輻射光源. 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在儲(chǔ)存環(huán)中加入插入件可以使同步輻射的亮度再提高千倍以上，得到的同步輻射主要來(lái)自插入件。上海光源（SSRF）。,元素成像原理,An

4、electron in the inner shell (e.g. K shell) is ejected from the atom by an external primary excitation x-ray, creating a vacancy. An electron from outer shell "jumps in" to fill the vacancy. In the process, it e

5、mits a characteristic x-ray unique to this element and in turn, produces a vacancy in the outer shell.,元素成像原理,熒光產(chǎn)額 較低的原子序數(shù)Z的元素，熒光產(chǎn)額較低 原則上， 可測(cè)元素Z>4 實(shí)際工作中 Z>11 （空氣吸收）光線能量,同步輻射元素成像設(shè)備,光學(xué)部分,成像設(shè)備,De

6、tection limit: 10-18 g， ~103 atoms Nat Phys,2006, 2:101–104lateral resolution: 50 nm Anal Chem, 2003, 75:3806–3816,樣品測(cè)試部分,信號(hào)處理部分,XRF spectra,Typical energy dispersive XRF spectrum for a multi-element standardE: qual

7、itative analysis peak eara: quautification,生物樣品中微量元素的空間分布,吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、蓄積、代謝生理生化功能作用機(jī)制實(shí)例,1 mm,Schematic drawing of anatomical structures of an adult hermaphrodite C. elegans,Elemental distribution in C. elegans w

8、hich was fed by E. coli OP50+ PBS (A), E. coli OP50 + nano Cu (B), and E. coli OP50 +Cu2+ (C).,JAAS, 2008, 23, 1121–1124,,模式動(dòng)物 2D,3.5×5.0 μm at BL-4A in, KEK,Cyclotella meneghiniana account for 20% of glob

9、al carbon fixation. facilitate the transport of photosynthetically fixed CO2 from the surface ocean to deep water , 10μm 制樣 細(xì)胞懸液滴加在電鏡柵網(wǎng)上，自然風(fēng)干定量 XRF standards NIST 1832 ,1833,Quantitative 3D elemental microtom

10、ography of Cyclotella meneghiniana at 400-nm resolution PNAS, 2010，107，15676-15680,XRF microprobe at beamline 2-ID-E of the Advanced Photon Source Following monochromation the X-ray beam was

11、focused to a spot of approximately 270 nm diameter using a Fresnel zone-plate objective. Fluorescence spectra were recorded at 150 nm intervals as the specimen was raster scanned through the focus of the X-ray

12、beam to obtain 2D projection images. The flux transmitted by the sample was monitored using both an ion chamber and a configured detector. A rotation series was obtained by acquiring such images with the specimen oriente

13、d at 24 different angles with respect to a vertical rotation axis.,Quantitative 3D elemental microtomography of Cyclotella meneghiniana at 400-nm resolution PNAS, 2010，107，15676-15680,240,000

14、single-point 24 projections 36 h (0.1 S/pixel),Quantitative 3D elemental microtomography of Cyclotella meneghiniana at 400-nm resolution PNAS, 2010, 107, 15676-15680,Cyclotella meneghinia

15、na中元素 的3D 分布P, K, Ca 分布的細(xì)胞器官類(lèi)似，少量Mn存在于同一區(qū)域Si 主要分布在細(xì)胞壁，F(xiàn)e、Mn在細(xì)胞壁呈環(huán)狀分布Cl, Cu, Zn，S分布于沿硅藻內(nèi)軸向分布的柱狀區(qū)域內(nèi)元素總含量相差3個(gè)數(shù)量級(jí) 8 μg for Si ， 2 ng for Mn.,各元素分布圖疊加PNAS, 2010, 107, 15676-15680,沿硅藻軸向分布的柱狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)為細(xì)胞質(zhì)，主要含Cl, Cu,

16、Zn, 和 S，這些元素在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)也有一薄層分布三個(gè)球狀細(xì)胞器主要含K, P和Ca，也有少量 Mn, Cu和Ni; 其中兩個(gè)與柱狀結(jié)構(gòu)連接，一個(gè)位于硅藻瓣端,C. meneghinianas三維結(jié)構(gòu)的元素分布細(xì)節(jié)PNAS, 2010, 107, 15676-15680,(A–C) Si (灰)， Fe (橙) ， Mn (紅)在硅藻縱斷面上的 分布. A 三元素分布細(xì)節(jié)，在含Si的硅藻細(xì)胞壁上還含有Fe和Mn. 二者在細(xì)胞壁特定部位

17、呈環(huán)狀分布。 Mn 結(jié)合于硅藻瓣面和環(huán)帶交界的富硅環(huán)狀結(jié)構(gòu)上。 B Si和Mn分布，在細(xì)胞下部一個(gè)硅化較輕的環(huán)狀區(qū)正好與Fe環(huán)狀結(jié)構(gòu)之一重合。該區(qū)域正是細(xì)胞伸展區(qū)，靠近硅藻細(xì)胞膜上殼和較小的新形成的子殼之間的連接區(qū)。C 表示 Mn和 Fe的分布, 在瓣與環(huán)帶鏈接區(qū)有一個(gè)Fe、Mn共存區(qū) 。(D–F) P (藍(lán)), S (黃), Cl (黃綠), 和Zn (紫)在硅藻縱向切片上的分布以及他們間的聯(lián)系。兩個(gè)主要的含磷結(jié)構(gòu)，S和Cl共存

18、于中央獨(dú)立的柱狀結(jié)構(gòu)以及緊鄰細(xì)胞膜下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的局部區(qū)域，含磷細(xì)胞器與柱狀結(jié)構(gòu)鏈接，大的液泡空腔，Zn在柱狀結(jié)構(gòu)內(nèi)富集，Zn與S、Cl相關(guān)。(G) 硅藻的橫斷截面表明柱狀結(jié)構(gòu)和空泡，兩個(gè)含磷結(jié)構(gòu)與柱狀結(jié)構(gòu)相連。,,,實(shí)測(cè)值和重建數(shù)據(jù)（36.0°）,實(shí)測(cè)值體現(xiàn)了硅藻的真實(shí)結(jié)構(gòu)，Si, Fe, 和 Mn界定了硅藻的細(xì)胞膜，Ca, K, 和 P 在三個(gè)球狀細(xì)胞器內(nèi)， Zn, Cu, S 分布于細(xì)胞質(zhì).重建數(shù)據(jù)與實(shí)測(cè)值無(wú)明顯差別，

19、重建效果好。大多數(shù)情況下，實(shí)測(cè)值和重建值之間的差別在2-3像素之內(nèi)，據(jù)此估計(jì)成像分辨率在400nm左右。 PNAS, 2010, 107, 15676-15680,,,XAS 成像,Localizing the Biochemical Transformations of Arsenate in a Hyperaccumulating Fern,蜈蚣草Pteris vittata,Spot size 15 or 5 μm dia

20、meter focused by tapered metal monocapillaries鮮活組織，室溫，潮濕定量：0.2μL 5 mM Arsenate滴于濾紙,Localizing the Biochemical Transformations of Arsenate in a Hyperaccumulating Fern,Localizing the Biochemical Transformations of Arsena

21、te in a Hyperaccumulating Fern,As(glutathione)3 11869.8 eVArsenite 11871.4 eVArsenate 11874.8 eV,EST, 2006, 40, 5010-5014,,Localizing the Biochemical Transformations Of Arsenate in a Hyperaccumulating Fern,XAS 成像,EST,

22、2006, 40, 5010-5014,XAS 成像,Localizing the Biochemical Transformations of Arsenate in a Hyperaccumulating Fern,方法評(píng)價(jià),非破壞性 制樣簡(jiǎn)單 避免污染 后續(xù)研究靈敏度高 多元素分析 高通量 元素間的相互作用空間分辨率,,Biological,Samples,,SR,,,45°,,,,Si(Li) detect

23、or,,,,Amplifier,,,,,MCA,,,,Computer,,,,,,Slit,,,,Ionization,chamber,,,Sample moving,direction,,IEF,separation,,SIGOUT,,Reconstruction,,,Protein,extraction,,,,,Detection of metalloproteins with SRXRF after electrophoresis

24、,Gao Y, Anal. Chem. Acta, 2003, 485(1): 131-137Gao Y, Analyst, 2002, 127, 1400-1404 Gao Y, JAAS, 2007, 22, 856–866,Detection of mercury-, arsenic-, and selenium-containing proteins in fish liver from a mercury polluted

25、 area of Guizhou Province, China with SRXRF after IEF,Se /As /Hg often co-exist in the same band, suggesting that The bands may be corresponding to the antagonistic effect of Se against the toxicity of Hg and As, Hg and

26、As may be involved in the same metabolic processes.,,,,,,,,,Li LN, J Toxicol Env Health, A, 2008, 71: 1266–1269,Imaging Metals in Proteins after native Electrophoresis,XRF map of a one-dimensional native-PAGE blot of mul

27、tiple metalloproteins. (Upper right) Photograph of blot. (Upper left) Zinc map shows zinc present in carbonic anhydrase (CA). (Lower left) Iron map shows iron present in hemoglobin (Hb). (Lower right) Copper map shows co

28、pper present in tyrosinase (Tyr), as well as a contaminant in carbonic anhydrase. Maps displayed are quantified, with threshold values in g/cm2.,ACS CHEM BIOL,2010,5,577-587,Detection of Se-containing proteins in seleni

29、um-enriched yeast with SRXRF after 2-dimensional gel electrophoresis,About 30 Se-containing proteins can be distinguished by Comparison between the two Figs, whitch were marked with ellipses in Fig.,Metallome of Nile til

30、apia tissue identified by SRXRF after 2D-PAGE separation,Gel obtained for the liver samples with the protein spots which were detected calcium, iron and zinc by SRXRF highlighted with a circle.,Three-dimensional protein

31、spots of liver sample contained calcium, iron and zinc, which highlighted with a circle.,Talanta,2010,82,1052-1056,準(zhǔn)在線聯(lián)用技術(shù)非破壞性、基底影響小同時(shí)給出蛋白質(zhì)表達(dá)水平、等電點(diǎn)、分子量、所含金屬種類(lèi)、含量等信息（價(jià)態(tài)、肽質(zhì)指紋譜、序列）多元素分析，可用于研究不同元素之間的協(xié)同、拮抗等生物效應(yīng)研究,方法評(píng)價(jià),X-ra

32、y absorption spectroscopy,I = I0·e -μd，線性吸收系數(shù)μ＝f(Z, ?, ?)XAS:透射光強(qiáng)度隨入射光波長(zhǎng)的變化曲線,X射線吸收譜,E0±10,E0+10-50,E0+50-1000,XANES:X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)： 元素種類(lèi)、電子構(gòu)型（價(jià)態(tài)）、對(duì)稱性NEXAFS:近邊X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)： 鍵角、鍵長(zhǎng)EXAFS:擴(kuò)展X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)：配位原子種類(lèi)、數(shù)目、距離,EXA

33、FS優(yōu)點(diǎn),不依賴晶體結(jié)構(gòu)，因此可用于大量的非晶態(tài)材料的研究不受其他元素的干擾，對(duì)不同的元素的原子，可由吸收邊位置不同，而得以分別研究可測(cè)配位原子的種類(lèi)、個(gè)數(shù)、間距等濃度很低的樣品，百萬(wàn)分之幾的元素也能分析樣品制備比較簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)收集時(shí)間短,XAS measurement after SRXRF imaging,Protein map (a) and Cr map (b) for Cr compounds binding to al

34、bumin-depleted bovine serum (BS) proteins. The main protein bands at 65 and 130 kDa correspond to monomeric and dimeric forms of BSA, respectively, total protein content in each lane is 10 µg. Lane 1: BS. Lane 4: GS

35、H (5.0 mM), Lane 2,3: Cr(III), Cr(IV) (1.0 mM)+BS. Lane 5,6:Cr(IV), Cr(III)-(1.0 mM) + GSH (5.0 mM). Lane 7: Cr(III)-propionate, 1.0 mM). All Cr compounds were incubated with serum proteins (1.0 mg protein per mL in 20 m

36、M HEPES buffer, pH 7.4) for 2 h at 310 K prior to the separation by SDS-PAGE.,,ACS CHEM BIOL,2010,5,577-587,硒對(duì)植物體內(nèi)汞的生物學(xué)行為及效應(yīng)的影響,植物是食物鏈的基礎(chǔ)，降低植物重金屬的含量或改變其形態(tài)是防止重金屬危害人體健康的有效途徑。 利用上海同步輻射裝置研究植物對(duì)汞的吸收以

37、及汞在植物體內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)化、蓄積情況，研究硒對(duì)這些過(guò)程的影響，包括這種影響的劑量效應(yīng)關(guān)系以及影響機(jī)制。,實(shí)驗(yàn)方案（研究?jī)?nèi)容、實(shí)驗(yàn)方法）,植物培養(yǎng),汞處理,硒&汞處理,對(duì)照植物,實(shí)驗(yàn)植物,根,莖,葉,根,莖,葉,冷凍切片,40µm薄片,葉基部葉尖部,干燥保存,X射線熒光成像,XAS,生長(zhǎng)狀態(tài),元素含量,,硒對(duì)汞植物毒性的影響,硒、汞均有植物毒性，且汞大于亞硒酸鹽大于硒酸鹽，毒性隨劑量升高加大，低濃度時(shí)硒表現(xiàn)毒物興奮效應(yīng)

38、硒可抑制汞植物毒性，抑制作用隨硒汞濃度增加變得更顯著，表現(xiàn)明顯的拮抗作用,不同劑量硒汞條件下的植物生長(zhǎng)抑制指數(shù),硒對(duì)植物體內(nèi)汞蓄積的影響,低汞條件下，硒可增加植物體內(nèi)的汞積累高汞條件下，硒降低植物汞積累（莖除外）不同濃度硒汞條件下培養(yǎng)植物組織中的汞蓄積a,b,c Hg濃度0.01 ppmd,e,f Hg濃度1 ppmg,h,i Hg濃度100 ppm,硒對(duì)植物體內(nèi)汞吸收、蓄積的影響,左圖 含汞（上）、硒汞（下）介質(zhì)中培

39、養(yǎng)的大蒜根部切片的微束SRXRF元素成像圖 汞主要分布在根部外表皮和中柱鞘部位 ，加硒可抑制植物對(duì)汞的吸收，使中柱鞘部位汞分布減少，降低了汞向上輸運(yùn)的可能。,右圖 含汞(上)、硒汞（下）介質(zhì)中培養(yǎng)的大蒜莖部切片的微束SRXRF元素成像圖,Hg,Hg,Hg,Hg,Se,Se,汞主要分布在莖部外表皮加硒促進(jìn)汞在莖部外周的蓄積，莖部汞來(lái)源于與之直接接觸的培養(yǎng)介質(zhì)。硒主要分布于中柱，由根部轉(zhuǎn)運(yùn)而來(lái)。,從葉基部到葉尖汞逐漸增加硒逐漸減少。