分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用工具酶總結(jié)

1、現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊工具酶工具酶基因工程：在人工可以控制條件下，將基因剪切或重新組合，再導(dǎo)入另一生物體內(nèi)，使這些基因在其中表達(dá)并遺傳下去的一門技術(shù)。核心：對基因進(jìn)行人工切割、連接和重新組合，構(gòu)建重組DNA。工具酶：在基因工程的重組DNA過程中，所需要用到的酶的統(tǒng)稱。一、限制性內(nèi)切酶（限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）主要功能：對外源性的雙鏈DNA進(jìn)行切割、水解，不允許外源性DNA存在于

2、細(xì)菌自身細(xì)胞內(nèi)。（這種酶能對在自身細(xì)胞內(nèi)存在的DNA種類給予限制——限制性內(nèi)切酶）限制修飾系統(tǒng)：合成限制性內(nèi)切酶的細(xì)胞，其自身的DNA不受酶的切割，這是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞還會(huì)合成一種修飾酶，可以對自身DNA進(jìn)行修飾，即改變DNA原來具有的可以被限制性內(nèi)切酶識別的核酸順序結(jié)構(gòu)，從而不被限制性內(nèi)切酶識別及切割、水解。保護(hù)自身遺傳物質(zhì)穩(wěn)定的機(jī)制。限制性內(nèi)切酶：從原核生物中發(fā)現(xiàn)的，約600種，可識別108種不同的特定DNA順序。以內(nèi)切方式水解核酸鏈中

3、的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生DNA片段的5’端為P，3’端為OH。命名：獲得該酶的細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母（大寫）該菌種名的前兩個(gè)字母(小寫)株系的字母（小寫）或數(shù)字羅馬數(shù)字（同一株菌種不同內(nèi)切酶的編號）例：細(xì)菌屬名細(xì)菌種名菌株名稱限制酶名稱ArthrobacterluteusAluIEscherichiacoliRY13EcIBacillusamyloliquefaciensHHamHIHaemophilusinfluenzaeRdHindIII（

4、一）三種常用內(nèi)切酶（一）三種常用內(nèi)切酶1.I型限制性內(nèi)切酶型限制性內(nèi)切酶同時(shí)兼有切割DNA的功能和修飾酶的修飾功能。在酶的識別位點(diǎn)上，若DNA兩條鏈菌沒有發(fā)生甲基化，則行使內(nèi)切酶的功能，對DNA進(jìn)行切割，同時(shí)轉(zhuǎn)變成ATP酶。若DNA雙鏈中有一條鏈已發(fā)生甲基化，則此類酶顯示修飾酶的作用，對另一條DNA進(jìn)行甲基化修飾，然后在行切割功能。（實(shí)際上，有內(nèi)切酶、修飾酶、ATP酶及解旋酶四種功能）I型限制性內(nèi)切酶在DNA鏈上的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一

5、致，也不固定。沒有時(shí)間應(yīng)用價(jià)值?！綝NA甲基化：DNA化學(xué)修飾的一種形式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)（外遺傳機(jī)制）。多發(fā)生于CpG二核苷序列上（在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸中的胞嘧啶被選擇性添加甲基，形成5甲基胞嘧啶）。甲基化位點(diǎn)可隨DNA的復(fù)制而遺傳（DNA復(fù)制后，甲基化酶用選擇專一性不同而產(chǎn)生相同黏性末端的兩種酶切割兩條不同的DNA片段，可使重組后的DNA片段不再被原來的酶所切割。如：SalI酶切割后

6、產(chǎn)生的黏性末端，XhoI酶切割后產(chǎn)生的黏性末端，兩者經(jīng)連接酶連接產(chǎn)生的序列，既不被SalI酶切割，也不被XhoI酶切割。②在同一位置上切割DNA雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。如：（二）其他類型內(nèi)切酶（二）其他類型內(nèi)切酶1.同工酶（Boschizomer）：來源不同的兩種II型內(nèi)切酶，它們識別核苷酸順序及切割位點(diǎn)都相同，差別只在于當(dāng)識別核苷酸序列中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種內(nèi)切酶可以切割，而另一種不能。如：HpaII和MspI識別順序都是5’CCGG

7、3’，若其中有5甲基胞嘧啶，則只有Msp酶可切割（GGmCC）。2.Subset酶：識別順序及切割位點(diǎn)相互有關(guān)的酶，互稱Subset酶。如：SamI酶所識別的6個(gè)核苷酸順序中含有HpaII酶識別的4個(gè)核苷酸順序。所以這兩個(gè)酶可以相互代替使用，它們所切割的DNA片段可以相互連接。3.可變酶（特殊的）：識別核苷酸順序一般都大于6個(gè)，但其中一個(gè)或幾個(gè)核苷酸時(shí)可以變化的。4.遠(yuǎn)距離切割酶：識別核苷酸順序的位置與切割的位點(diǎn)不一致，一般切割位點(diǎn)與指

8、標(biāo)核苷酸順序的位置之間有10個(gè)左右核苷酸的距離。與I型內(nèi)切酶相似，不過I型內(nèi)切酶識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)的距離更遠(yuǎn)一些。（三）甲基化酶（不屬于內(nèi)切酶）（三）甲基化酶（不屬于內(nèi)切酶）使識別順序中的某個(gè)核苷酸發(fā)生甲基化，保護(hù)DNA不被限制性內(nèi)切酶切開。M5C（5甲基胞嘧啶）大多數(shù)以M5CpG的形式存在，即CpG島中的C最容易是甲基化的底物，而甲基化又與受之調(diào)控的基因的表達(dá)程度有關(guān)。因此，研究CpG島的甲基化是研究基因調(diào)控的一個(gè)重要方向。當(dāng)甲基化酶