實(shí)驗(yàn)4-細(xì)胞骨架的顯示及觀察

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)42015413實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)4細(xì)胞骨架的顯示及觀察細(xì)胞骨架的顯示及觀察姓名：李思露學(xué)號(hào)：131140040一、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握用考馬斯亮藍(lán)R250染色觀察動(dòng)物和植物細(xì)胞骨架的原理和方法。2.了解免疫熒光法檢測細(xì)胞成分的原理和方法。二、二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理1.細(xì)胞骨架：指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。狹義的細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架，包括微管（micr

2、otubule，MT）、微絲（microfilament，MF）、中間纖維（intermediatedfilament，IF）。2.微管微管是細(xì)胞內(nèi)由微管蛋白形成的直徑約20~26nm的長度不一的小管。分布在核周圍，呈放射狀向胞質(zhì)四周擴(kuò)散，主要確定膜性細(xì)胞器的位置和作為膜泡運(yùn)輸?shù)膶?dǎo)管。微管蛋白有α和β兩種。αβ異二聚體沿縱向聚合成絲，原絲成環(huán)狀排列形成微管的壁。微管不穩(wěn)定，對(duì)低溫（冷凍）、高壓等物理因素及秋水仙素（微管斷裂劑）等化學(xué)因素

3、敏感。紫杉醇可以和微管蛋白多聚體結(jié)合，抑制微管解聚。3.微絲：真核細(xì)胞內(nèi)是主要由肌動(dòng)蛋白（actin）組成的直徑為5～7nm的骨架纖絲。主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)，作用是確定細(xì)胞表面特征、并與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、收縮、內(nèi)吞等功能有關(guān)。脊椎動(dòng)物肌動(dòng)蛋白分為α、β和γ三種類型，不同種類細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白組成不同。肌動(dòng)蛋白單體為球形，依次連接成鏈，兩串肌動(dòng)蛋白鏈互相纏繞扭曲成一股微絲。細(xì)胞松弛素B為微絲斷裂劑。4.中間纖維：直徑介于微絲和微管之間（7~11n

4、m）、由多種不同蛋白組成的細(xì)胞骨架細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)42015413（4）用M緩沖液配制的3.0%戊二醛。（5）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染液。（6）0.9%氯化鈉生理鹽水。（三）用品普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、水浴箱（37℃）小剪刀、鑷子、5mL一次性塑料注射器、膠頭吸管、1.5mLEP管、1.5mL試管架四、四、實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作考馬斯亮藍(lán)染色法顯示洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞骨架（1）材料準(zhǔn)備：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，裁成大小0.5cm０.５ｃｍ

5、的小片。（2）PBS平衡：放入盛有1mL6mmolL磷酸鹽緩沖液（pH6.8）的EP管中，靜置使材料下沉（完全浸透）；然后用膠頭滴管吸棄液體。（3）TritonX100處理：加1mL1%TritonX100溶液處理20min，然后用膠頭滴管吸棄液體。（4）洗滌：用M緩沖液洗滌3次，每次加1.5mL溶液浸泡5min，然后用膠頭滴管吸棄液體。（5）固定：加1mL3.0%戊二醛固定30min然后用膠頭滴管吸棄液體。（6）洗滌：用PBS洗滌3次

6、，每次浸泡5min然后用膠頭滴管吸棄液體。（7）染色：用0.5~1.0mL0.2%考馬斯藍(lán)R250染液染色10min。（8）洗滌：用蒸餾水洗滌數(shù)遍。（9）制備裝片：給載玻片中央加1滴水，用鑷子夾取樣品在其中展開，然后加蓋玻片。（10）顯微觀察：在普通光學(xué)顯微鏡下，洋蔥細(xì)胞骨架為布滿細(xì)胞的藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。（11）對(duì)照樣品：①省去步驟（3），不用TritonX100處理；②省去步驟（4）用TritonX100處理后不用M緩沖液洗滌。五、五、實(shí)