試驗方法

1、實驗內(nèi)生真菌的分離及鑒定實驗學時：18實驗類型：綜合實驗要求：選修一、實驗?zāi)康?.了解真菌形態(tài)的基本特征。2.掌握絲狀真菌制片方法和真菌鑒定方法。二、實驗內(nèi)容采集植物樣品包括葉、莖、根、花、種子或果實，然后對分離樣品的內(nèi)生真菌，并進行形態(tài)和分子生物學方法的鑒定。三、實驗原理、方法和手段（一）實驗原理根據(jù)真菌的形態(tài)特征和ITS序列等分子證據(jù)對分離到真菌進行歸類和鑒定。（二）實驗手段和方法1、內(nèi)生真菌分離純化方法1.1樣品的表面消毒及預(yù)處理

2、分別取根、莖、葉、果實，用洗滌劑在自來水下洗凈。老樹皮用75酒精進行表面消毒后，用鑷子取出，于酒精燈上燒灼15秒至表面焦糊，切成11cm2大小置于PDA固體培養(yǎng)基上。對于根、莖、葉、果實按下列程序進行表面消毒：75的酒精漂（浸）洗23min→無菌水沖洗46次→0.1升汞不同的消毒時間（共設(shè)置7個梯度）→無菌水沖洗46次→用滅菌濾紙吸干多余水分→無菌刀片將材料切成小塊將根、莖的表皮、韌皮部、木質(zhì)部大致分開，并切成0.50.5cm2大小。將

3、果實的外種皮去掉，消毒之后將內(nèi)種皮去掉。滅菌時，瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯中，記好時間，倒入消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前12分鐘，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪漂洗。滅菌時間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時為止。滅菌液要充分浸沒材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。1.2內(nèi)生真菌

4、的分離與純化將上述組織塊置于分離培養(yǎng)基上（每一平皿培養(yǎng)5塊組織塊）于27℃恒溫培養(yǎng)，同時將上述消毒過程中最后一次沖洗組織塊后的無菌水滴在培養(yǎng)基上平行培養(yǎng)，用以檢測消毒是否徹底。觀察菌絲生長情況及污染情況。培養(yǎng)34天后及時采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌絲或菌落移種到新鮮PDA培養(yǎng)基上。純化34次以保證所得菌落為純培養(yǎng)。2、真菌的形態(tài)學鑒定方法對分離到的內(nèi)生真菌的分類鑒定主要根據(jù)宏觀的培養(yǎng)性狀（菌落形態(tài)），微觀的個體形態(tài)特征及一些生物

5、學特性進行經(jīng)典分類研究。2.1培養(yǎng)性狀（菌落形態(tài)）培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基（Czapekagar）、沙氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。方法：將固體培養(yǎng)基制成平板，以點植法接鐘，即用接種針尖沾取少量孢子點植在平板的中心位置，然后于2528℃培養(yǎng)一定時間（通常為7天或14天）進行觀察，觀察時可用肉眼或借助放大鏡等。觀察的要點：大?。阂跃涞闹睆剑╩m）表示。顏色：包括菌落表面和背面的顏色，及色素是否滲入培養(yǎng)基。菌落表面的紋飾：如皺紋、輻射溝紋、同心環(huán)、整

6、個菌落致密或疏松等。菌落的質(zhì)地：氈狀、毯狀、絨毛狀、棉絮狀、粉粒狀、革質(zhì)狀、有無成束狀或繩狀的氣生菌絲。菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分狀況等。菌落邊緣：全緣、鋸齒狀、樹枝狀等。滲出物：菌落表面有無液滴及液滴的顏色等。2.2個體形態(tài)菌絲的特征：表面性狀（粗糙或光滑），寬度等分生孢子梗：分支情況簡單或復(fù)雜，輪生或單生等；長短；基部粗糙或光滑等。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征：形狀，大小，著生狀況（位置，單生、互生或成輪生體）分生孢子的形態(tài)

7、：形狀，大小，表面狀況，聚集方式（直鏈、斜鏈或聚集成頭）2.3真菌制片方法——粘片法膠帶粘貼法：選用在顯微鏡油鏡下觀察細致不粗糙且粘性好的膠帶。取一小段膠帶從菌落表面的中心向邊緣粘，75乙醇固定，乳酸石炭酸棉藍染色液染色，將粘有菌絲的一面向上，蓋上蓋玻片，于顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征。2.4顯微攝影照片在Motic數(shù)碼顯微鏡下，觀察并選取具典型性狀特征的視野拍照、直接測量相關(guān)數(shù)據(jù)和進行描述記載。2.5菌種的鑒定根據(jù)描述的菌種的特征，索引

8、分析相關(guān)文獻，綜合分析對比相關(guān)特征的異含量的DNA。用CTAB法提取材料DNA的具體步驟如下：1將CTABbuffer在65℃水浴鍋中預(yù)熱，研缽用液氮預(yù)冷；2取0.1g左右菌絲體，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入5mL預(yù)熱的提取液及10μLβ巰基乙醇，混合均勻后把混合液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中700μL管；3于65℃水浴保溫0.51h，時間不能超過1.5h。保溫期間要輕輕振搖幾次；4冷卻至室溫后，加入等體積700μL的飽和酚：氯仿：異戊

9、醇25：24：1，充分混勻后靜置10min5離心12000rpm，10min，室溫，去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入干凈離心管中。6根據(jù)雜質(zhì)的去除情況重復(fù)步驟4、5數(shù)次，直至無雜質(zhì)；7加入等體積氯仿：異戊醇24：1抽提一次以去除飽和酚，離心12000rpm，10min，室溫；8將上清液逐滴加入兩倍體積的20℃預(yù)冷無水乙醇，以沉淀出DNA。室溫放置1020min，可以過夜；9挑取或離心去上清液10000rpm，5min的方法取出DNA；用75乙醇洗滌