蚜蟲基因組dna提取方法的改進

1、蚜蟲基因組DNA提取方法的改進3楊子祥陳曉鳴33馮穎繆迎春(中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所云南昆明650224)MethodimprovementfextractiongenomicDNAfromaphids.YANGZi2XiangCHENXiao2Ming33FENGYingMIAOYing2Chun(ResearchInstituteofResourceInsectsChineseAcademyofFestryKunmingYu

2、nnan650224China)AbstractThetraditionalSDSmethodwasmodifiedftheisolationofthegenomicDNAfromaphidswithsmallbodysurfacecoveredbyexoskeleton.ComparedwiththetraditionalSDSmethodthissimpleeffectivemethodavoidsgrindingtissueiss

3、uitableftheextractionofDNAfromsingleaphid.GenomicDNApreparedbythisnewmethodissuitablefPCRamplificationusingRAPDromprimerssequencingprimers.KeywdsaphidgenomicDNAextractionimprovement摘要蚜蟲基因組DNA的提取是蚜蟲分子生物學研究中的難點。參照動物基因組DNA的

4、提取方法根據(jù)蚜蟲體型微小體表有外骨骼的特點對SDS法作了改進。改進的方法無需用組織搗碎棒破碎蟲體操作簡便。與現(xiàn)在常用的提取方法相比改進的SDS法能快速、有效地提取單頭蚜蟲的基因組DNA適用于RAPD隨機引物和測序引物的PCR擴增。關(guān)鍵詞蚜蟲基因組DNA提取方法改進3科技部基礎(chǔ)性研究項目(2000DEB100035)。33通訊作者收稿日期:2005212227修回日期:2006201212運用分子生物學技術(shù)從核酸水平研究昆蟲的分類和鑒定、

5、生物型的識別、遺傳多樣性分析等是現(xiàn)代昆蟲分子系統(tǒng)學和昆蟲遺傳學的研究熱點之一開展這類研究的基礎(chǔ)工作是基因組DNA的提取[1]。在昆蟲分子遺傳學研究中由于研究的樣本量較大除了要獲得質(zhì)量和數(shù)量合乎要求的DNA外還需要提取方法簡便易行容易掌握成本較低[2]。蚜蟲是一類分布廣寄主廣泛經(jīng)濟價值較高的昆蟲世界上已知種類為4000多種[3]我國已報道的種類1000余種[4]。蚜蟲大多數(shù)是害蟲它們刺吸植物汁液直接影響植物生長同時間接傳播病毒病害造成農(nóng)業(yè)

6、上的損失如棉蚜Aphisgossypii、麥長管蚜Macrosiphumavenae等少數(shù)種類如五倍子蚜蟲(倍蚜)是重要的資源昆蟲具有較高的經(jīng)濟價值[5]。蚜蟲身體微小形態(tài)特征不顯著生活習性復雜并具有多型多態(tài)現(xiàn)象在分類和鑒定、近緣種的識別等方面?zhèn)鹘y(tǒng)的研究方法往往難以發(fā)揮作用[6]。分子遺傳標記具有穩(wěn)定性高、受環(huán)境條件影響小信息含量豐富等優(yōu)點非常適合于蚜蟲的研究[7]。蚜蟲基因組DNA的提取是開展蚜蟲分子遺傳學研究的難點Black等采用了

7、SDS法提取蚜蟲基因組DNA并用于RAPD擴增[8]楊效文等在煙蚜Myzuspersicae(Sulzer)的研究中采用KAC法提取煙蚜的DNA[9]安瑞生等對KAC法做了改進[10]以后的蚜蟲研究人員大多采用這種方法[11]。近十幾年來蚜蟲分子生物學研究有了較大的發(fā)展但對蚜蟲DNA提取方法進行探索和比較的研究較少。本試驗嘗試和比較了上述幾種方法并以動物基因組DNA的提取方法為基礎(chǔ)[12]根據(jù)蚜蟲體型微小體表有幾丁質(zhì)外骨骼的特點對SDS

8、法作了改進改進的方法無需用組織搗碎棒破碎蟲體操作簡便能快速、有效地提取單頭和多頭蚜蟲的基因組DNA。088昆蟲知識ChineseBulletinofEntomology200643(6)B(KAC3molΠLpH=712)冰上放置1h以上12000rΠmin離心10min取上清液。加入240μLTris飽和酚混勻12000rΠmin離心10min取上清液。加入200μL冷無水乙醇(預置于20℃)20℃度冰箱內(nèi)放置1h以上。12000rΠ

9、min離心15min傾去上清液。加入100μL冷的70%乙醇(預置于7℃)12000rΠmin離心10min傾去上清液。自然干燥后加入20μLddH2O溶解。114DNA濃度和純度檢測采用1%的瓊脂糖88V(4VΠcm)上樣量為每孔210μL電泳70min0105%EB染色紫外燈下觀察、照相和分析。用GeneRuler100bpDNALadderPlus作為分子量的標準并用λDNA(50ngΠμL)估算分子量大小。用核酸蛋白質(zhì)分析儀測定

10、OD260和OD260Π280。115PCR擴增選用RAPD隨機引物S7(5′2GGTGACGCAG23)、S118(5′2GAATCGGCCA23′)和EF1α、線粒體COⅡ基因測序引物對所提取的模板DNA分別進行擴增。PCR反應體系為20μL其中含1buffer215mmolΠLMgCl2015mmolΠLdNTP2UTaq酶66ng引物1μL模板DNA加入ddH2O至20μL。反應條件為:94℃5min后進行40個循環(huán)即94℃1m

11、in、36℃1min、72℃2min最后于72℃延伸10min保存于4℃。測序引物的反應體系同上反應條件為:95℃4min后進行35個循環(huán)即94℃1min、51℃1min、72℃1min最后于72℃延伸10min保存于4℃。將擴增后的DNA在115%的瓊脂糖凝膠上電泳上樣量為每孔210μL電壓為66V(3VΠcm)時間為90min電泳緩沖液為1TBE。0105%EB染色紫外燈下觀察、照相和分析。用GeneRuler100bpDNALad

12、derPlus作為分子量的標準。2結(jié)果與分析211不同方法提取基因組的檢測結(jié)果21111SDS法:5種倍蚜均獲得了DNADNA電泳條帶基本呈線形但有時會在DNA帶的前面出現(xiàn)少量拖尾。與λDNA對照DNA分子量大小約為48kb結(jié)構(gòu)較為完整。核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測結(jié)果:OD260Π280介于116～118之間可見DNA內(nèi)含有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)DNA的濃度因蟲體的大小不同有較大差異一般介于25～100ngΠμL平均濃度為60ngΠμL。2111

13、2改進的SDS法:5種倍蚜均獲得了DNADNA電泳條帶基本呈線形無明顯拖尾(圖1)。與λDNA對照DNA分子量大小約為48kb結(jié)構(gòu)較為完整。核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測結(jié)果:OD260Π280介于118～210間可見DNA內(nèi)的含有一定量的RNADNA的濃度介于20～50ngΠμL之間平均濃度為40ngΠμL。RNA對PCR擴增影響不大如果想去除RNA可在DNA溶解液中加入RNAase處理。圖1改進的SDS法提取的DNA電泳圖譜M.分子量標準λ.

14、λDNA(48kb)1～5.不同倍蚜的總DNA21113KAC法:DNA電泳圖譜沒有聚成條帶有時出現(xiàn)少量拖尾說明此法提取的DNA量很少雜質(zhì)較多。核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測結(jié)果:OD260Π280介于114～117之間表明DNA含量低并且含有較多的蛋白質(zhì)和酚(表2)。212PCR擴增結(jié)果21211RAPD隨機引物的PCR擴增:用引物S118擴增SDS法提取的DNA得到了豐富的多288昆蟲知識ChineseBulletinofEntomology