免疫熒光技術(shù)

1、免疫熒光技術(shù)（Immunofluescencetechnique）又稱熒光抗體技術(shù)。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。免疫熒光技術(shù)包括熒光抗體技術(shù)和熒光抗原技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。該技術(shù)的主要特點是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點是

2、：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。(一)原理與方法原理與方法免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。1.直接染色法將標(biāo)記的特異熒光抗體直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定

3、溫度和時間的染色，洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點是：特異性高，操作簡便，比較快速。缺點是：一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應(yīng)設(shè)陰、陽性標(biāo)本對照，抑制試驗對照。2.間接染色法如果檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，作用一定時間后，洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體即抗球蛋白抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)

4、，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應(yīng)，則抗體被固定或與熒光素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，形成抗原抗體抗抗體復(fù)合物，再洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標(biāo)記的抗體起著雙重作用，對抗原來說起抗體的作用，對第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標(biāo)本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標(biāo)記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動物血清球蛋白免疫其

5、他動物來制備。間接染色法的優(yōu)點是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動物的抗體結(jié)合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點是：由于參加反應(yīng)的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結(jié)果有時較難，操作繁瑣，對照較多，時間長。間接法應(yīng)設(shè)陰、陽性標(biāo)本對照，還應(yīng)設(shè)有中間層對照（即中間層加陰性血清代替陽性血清）。3.抗補(bǔ)體染色法抗補(bǔ)體染色法簡稱補(bǔ)體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser

6、等建立。本法利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光素標(biāo)記抗FITC含有異硫氰基，在堿性條件下能與IgG的自由氨基（主要是賴氨酸的ε氨基）結(jié)合，形成熒光抗體結(jié)合物。一個分子的IgG有86個賴氨酸殘基，但一般最多只能標(biāo)記1520個。①直接標(biāo)記法取抗體球蛋白溶液10ml，碳酸鹽緩沖液3ml，生理鹽水17ml，混合，在4℃電磁攪拌下加FITC3mg（先溶解在3ml緩沖液中），在4℃繼續(xù)攪拌46h，將結(jié)合物通過已平衡好的SephadexG25柱，以除去未

7、結(jié)合的游離熒光素。②透析標(biāo)記法將抗體球蛋白溶液用碳酸鹽緩沖液（0.25molL，pH9.0調(diào)動1%(WV)，并裝入透析袋中，按蛋白質(zhì)量的120稱取FITC溶于10倍抗體溶液量的碳酸鹽緩沖液中，將透析袋浸沒于FITC液中，于4℃攪拌1618h取出透析袋于0.01molL，pH7.2PBS中透析4h，將結(jié)合物通過已平衡好的SephadexG25柱，去除游離熒光素。(2)RB200標(biāo)記本品為無定形褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)

8、定，可長期保存，分子量為580，最大吸收光譜為570nm，呈明亮的橙色熒光，因與FITC的黃綠色有明顯區(qū)別，故被廣泛用于對比染色或用于兩種不同顏色的熒光抗體的雙重染色。方法為：取1gRB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳缽中研磨5min（在毒氣操作櫥中），加10ml無水丙酮，放置5min，隨時攪拌，過濾，用所得溶液進(jìn)行結(jié)合。將每亳升血清用1ml生理鹽水及1ml碳酸鹽緩沖液（0.5molL，pH9.5）稀釋，逐滴加入0.1mlRB200

9、溶液，隨加隨攪拌，在04℃繼續(xù)攪拌1218h。(3)TMRITC標(biāo)記TMRITC為紫紅色粉末，性能比較穩(wěn)定，分子量為443，最大吸收光譜為550nm，呈橙紅色熒光。其結(jié)合方法與FITC的直接標(biāo)記法相同，只是所加色素量為蛋白質(zhì)量的130140，結(jié)合時間持續(xù)1618h。（4）影響標(biāo)記的主要因素溫度、時間、酸堿度和標(biāo)記量4個因素。溫度低，標(biāo)記時間長，溫度高，標(biāo)記時間應(yīng)短。FITC04℃以612h為宜，2025℃以12h為宜，37℃3045mi