化妝品安全技術(shù)規(guī)范

1、1附件2細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)BacterialReverseMutationAssay1范圍本規(guī)范確定了細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測(cè)。2定義2.1回復(fù)突變r(jià)eversemutation細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營(yíng)養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。2.2基因突變genemutation在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對(duì)的排列順序發(fā)生變化。2.3堿基置換突變basesubs

2、titutionmutation引起DNA鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換。堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘌呤所代替。顛換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘧啶所代替。2.4移碼突變frameshiftmutation引起DNA鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。2.5細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)Bacterialrevers

3、emutationassay利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型→原養(yǎng)型回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。2.6S9經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和β萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。3原理鼠傷寒沙門氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)；大腸桿菌色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故

4、在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。4儀器和設(shè)備培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(80℃)或液氮3加蒸餾水至500mL配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰

5、箱。5.7鹽溶液(1.65molLKCl0.4molLMgCl2)成分：氯化鉀(KCl)61.5g氯化鎂(MgCl26H2O)40.7g加蒸餾水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。5.80.2molL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O)2.965g磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)29.015g加蒸餾水至500mL配制：溶解上述成分后，于0.1

6、03MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。5.9S9混合液成分每毫升S9混合液肝S9100μl鹽溶液20μl滅菌蒸餾水380μl0.2molL磷酸鹽緩沖液500μl輔酶II(NADP)4μmol6磷酸葡萄糖(G6P)5μmol配制：將輔酶II和6磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。5.10菌株鑒定用

7、和特殊用途試劑5.10.1組氨酸色氨酸生物素平板成分：瓊脂粉15g蒸餾水934mL(VB)培養(yǎng)基E20mL20%葡萄糖20mL滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g100mL)10mL滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g100mL)10mL滅菌0.5mmolL生物素溶液6mL配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，VB培養(yǎng)基、組氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時(shí)蒸餾水改為944ml）。待溶液稍微冷卻后，加