可將大腸桿菌分為150多型

1、生物學(xué)(選修1)生物學(xué)技術(shù)實踐,細(xì)菌的結(jié)構(gòu),基本結(jié)構(gòu)——細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、質(zhì)粒,特殊結(jié)構(gòu)——莢膜、菌毛、鞭毛、芽孢,一、細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu) Basical Structure of Bacterium,細(xì)胞壁 cell wall 1. 化學(xué)組分 聚糖骨架 肽聚糖 peptidoglycan 四肽側(cè)

2、鏈 G+菌 五肽交聯(lián)橋 磷壁酸 teichoic acid 肽聚糖 peptidoglycan 脂多糖 lipopolysaccharide,LPS G- 菌 脂質(zhì)雙層：內(nèi)有OMP

3、 外膜 脂蛋白,,,,,革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),質(zhì)粒（plasmid） 質(zhì)粒是染色體外的遺傳物質(zhì)，存在于細(xì)胞質(zhì)中。 為閉合環(huán)狀的雙鏈DNA，帶有遺傳信息，控制細(xì)菌某些特定的遺傳性狀。質(zhì)粒能獨立自行復(fù)制，隨細(xì)菌分裂轉(zhuǎn)移到子代細(xì)胞中。質(zhì)粒不是細(xì)菌生長所必不可少的，失去質(zhì)粒的細(xì)菌仍能正常存活。質(zhì)粒除決定該菌自身的某種性狀外，還可通過接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用等將有關(guān)性狀傳遞給另一細(xì)菌。質(zhì)粒編碼的細(xì)菌

4、性狀有菌毛、細(xì)菌素、毒素和耐藥性的產(chǎn)生等。,二、細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)　Special Structures of Bacterium,1. 莢膜 capsule 細(xì)菌細(xì)胞壁外包圍的一層粘液性物質(zhì)結(jié)構(gòu)。大多數(shù)為多糖，少數(shù)為多肽。厚度小于0.2 μm者稱微莢膜（microcapsule）。 莢膜的功能： ① 粘附作用； ② 抗吞噬作用； 　　　　　　 ③ 抗有害物質(zhì)的損傷作用。,

5、,莢膜（肺炎球菌）,2. 鞭毛 flagellum,由蛋白質(zhì)組成的結(jié)構(gòu)，與細(xì)菌的運動有關(guān)；具有免疫原性，有鑒別意義；某些菌的鞭毛與致病有關(guān)。,鞭 毛,3. 菌毛 pilus,定義：由蛋白質(zhì)組成，短而直，光鏡下不能觀察到。 普通菌毛ordinary pilus：是細(xì)菌的粘附結(jié)構(gòu)，能與宿主細(xì)胞的特異受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌在局部定植，與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)。 性菌毛 sex pilus: 數(shù)量少，中空呈管狀。由F

6、質(zhì)粒編碼產(chǎn)生，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)?？赏ㄟ^接合方式傳遞細(xì)菌的毒力和耐藥性等。,E. coli with fimbriae,4. 芽胞 spore,某些細(xì)菌在一定條件下，在菌體中形成的在光學(xué)顯微鏡下可見的一個圓形或卵圓型小體。

7、 芽胞是細(xì)菌的一種特殊存活方式，而不是繁殖方式。一個細(xì)菌只能形成一個芽胞，一個芽胞也只能生成一個菌體。產(chǎn)芽胞的細(xì)菌在未產(chǎn)生芽胞時的菌體稱為繁殖體（vegetative form）。,細(xì)菌芽胞的大小和位置,資料:大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli） 革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動物腸道中的正常

8、棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，其代謝活動能抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長，減少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對人體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。正常棲居條件下不致病。但若進(jìn)入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在腸道中大量繁殖，幾占糞便干重的1/3。兼性厭氧菌。,在環(huán)境衛(wèi)生不良的情況下，常隨糞便散布在周圍環(huán)境中。若在水和食品中檢出此菌，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)，從而可能有腸道病原菌的存在。因此，大腸菌群數(shù)（或大腸

9、菌值）常作為飲水和食物（或藥物）的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。大腸桿菌的抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗機體吞噬和抗補體的能力。根據(jù)菌體抗原的不同，可將大腸桿菌分為150多型，其中有16個血清型為致病性大腸桿菌，常引起流行性嬰兒腹泄和成人肋膜炎。大腸桿菌是研究微生物遺傳的重要材料，如局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)就是1954年在大腸桿菌K12菌株中發(fā)現(xiàn)的。萊德伯格（Lederberg）采用兩株大腸桿菌的營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行實驗，奠定了

10、研究細(xì)菌接合方法學(xué)上的基礎(chǔ)，以及基因工程的研究。,實驗一:大腸桿菌的培養(yǎng)和分離一、實驗?zāi)康?,1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增,利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2. 進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)。3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理。,二、實驗原理: 大腸桿菌的新陳代謝是異養(yǎng)兼性厭氧型，在生態(tài)系統(tǒng)的身份（消費者、分解者），因此可以用LB液體培養(yǎng)基（通用的細(xì)菌培養(yǎng)基或普通的細(xì)菌培養(yǎng)基）擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)后再

11、在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行分離，分離后，培養(yǎng)基上會形成一個個單獨的菌落，便于觀察鑒定。這種方法有利于消除污染雜菌，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡便方法之一。,,,,,進(jìn)行微生物的分離與培養(yǎng)屬于技能性獨立操作水平（ⅡA）,三、實驗操作要求：1.培養(yǎng)基的配比與制作 原理:培養(yǎng)基是微生物的生存環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì),必須無菌。俗話說，“細(xì)菌喜葷，霉菌喜素”，細(xì)菌培養(yǎng)基通常要用蛋白胨和酵母提取物配制,加入一定的氯化鈉（維持一定的滲透壓

12、）。細(xì)菌通常要求在中性偏堿的環(huán)境中生長，所以在配制培養(yǎng)基時需調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度。,（一）、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分,固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基,1、液體培養(yǎng)基,主要用于增菌培養(yǎng)、鑒別性培養(yǎng),2、固體培養(yǎng)基,用作微生物的分離、鑒定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物測定等,3、半固體培養(yǎng)基,觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。,（二）、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分,增殖培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基,1、增殖培養(yǎng)基,在普通培養(yǎng)基中加入一些某

13、種微生物特別喜歡的營養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，逐漸淘汰其它微生物，這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基。,增菌、運送用培養(yǎng)基,2、選擇培養(yǎng)基,在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的菌種生長的培養(yǎng)基，稱之為選擇培養(yǎng)基。,分離培養(yǎng)用的培養(yǎng)基,3、鑒別培養(yǎng)基,在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助開快速鑒別某種微生物。這樣的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)基。,鑒別用培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基的配方如下: 胰蛋白

14、胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化鈉(NaCl) 5g/L 另外根據(jù)經(jīng)驗值用NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH,使其達(dá)到7.4(該pH適合目前使用最廣的原核表達(dá)菌種E.coli的生長),（三）培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項,培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾澄清 培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的質(zhì)量測試培

15、養(yǎng)基的保存,范例解讀：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 　　　牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基.其配方如下: 牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl5g,瓊脂15～20g,水1000mL,PH7.4～7.6 1.稱藥品 按實際用量計算后,按配方稱取各種藥品放入大燒杯中.牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量,用熱水溶解后倒入大燒杯;也可放在稱量紙上稱量,隨后放入熱水中,牛肉膏使與稱量紙分離,立即取出紙片.蛋白胨極易吸潮,

16、故稱量時要迅速.,2.加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉網(wǎng)上,小火加熱,并用玻棒攪拌,待藥品完全溶解后再補充水分至所需量.若配制固體培養(yǎng)基,則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中,再加熱融化,此過程中,需不斷攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,最后補足所失的水分. 3. 調(diào)pH 檢測培養(yǎng)基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,邊加邊攪拌,并隨時用pH試紙檢測,直至達(dá)到所需pH范圍.若偏堿,則用lmol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)

17、.pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前.應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭,以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度.,4.過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾,固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾,以利培養(yǎng)的觀察.但是供一般使用的培養(yǎng)基,這步可省略. 5.分裝 按實驗要求,可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi).分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分裝量:固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5,滅菌后制成斜面.分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜.半固體培

18、養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜,滅菌后垂直待凝.,,6.加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞.棉塞的形狀,大小和松緊度要合適,四周緊貼管壁,不留縫隙,才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用.要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi),以防棉塞脫落.有些微生物需要更好的通氣,則可用8層紗布制成通氣塞.有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞.,7.包扎 加塞后,將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙,以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞.若培養(yǎng)

19、基分裝于試管中,則應(yīng)以5支或7支在一起,再于棉塞外包一層牛皮紙,用繩扎好.然后用記號筆注明,培養(yǎng)基名稱,組別,日期. 8.滅菌 將上述培養(yǎng)基于121.3℃濕熱滅菌20min.如因特殊情況不能及時滅菌,則應(yīng)故人冰箱內(nèi)暫存. 9.擺斜面 滅菌后,如制斜面,則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上,并調(diào)整斜度,便斜面的長度不超過試管總長的1/2. 10.無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h,無菌生長即可使用,或貯存于冰

20、箱或清潔的櫥內(nèi),備用.,2.無菌技術(shù)(滅菌操作):在培養(yǎng)微生物時必須進(jìn)行無菌操作。（1）各種器皿必須是無菌的，如各種大小的培養(yǎng)皿、試管等等通常用高壓蒸汽滅菌法滅菌（自主學(xué)習(xí)：P20-21）。（2）各種培養(yǎng)基也必須是無菌的。如加入培養(yǎng)基的三角瓶、試管也要在1210 C 下滅菌15min（自主學(xué)習(xí)：P21 ）。（3）在操作過程中必須是無菌的（菌轉(zhuǎn)移操作必須是無菌的）。在將培養(yǎng)基加入到三角瓶、試管和培養(yǎng)皿中時，三角瓶口、試管口、和培養(yǎng)

21、皿壁上不能沾有培養(yǎng)基，否則容易發(fā)生污染（自主學(xué)習(xí)：P21 ）,無菌操作,斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞,檢驗操作過程的無菌操作要求,（1）、在操作中不應(yīng)有大幅度的動作；（2）、使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。（3）、在正火焰上方操作；（4）、接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5）、在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)。（6）、不能用嘴直接吸吹吸管。（7）、

22、帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。,3.接種之平板劃線操作如果用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線的過程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少。劃線最后，可使細(xì)菌間的距離加大。在培養(yǎng)10~20h后，可由一個細(xì)菌產(chǎn)生單個菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細(xì)菌產(chǎn)生的后代。“龍生九子，各有不同”。例如：我們要篩

23、選乳酸菌，可用斜面擴(kuò)增的菌制作酸奶，根據(jù)效果不同，如發(fā)酵時間快慢不同、口感不同、發(fā)酵是條件不同等等，篩選出工作菌株。劃線分離法也可將污染的雜菌除去，如乳酸菌是厭氧菌，但時間長了也有可能被需氧雜菌污染，因此在制成酸奶時，酸奶上,層會有麻穌的口感。將菌種重新劃線分離后，可除去需氧雜菌。用于基因工程的大腸桿菌的工程菌，也可用劃線分離法獲得產(chǎn)物表達(dá)能力高的菌株。由于工程菌的質(zhì)粒中通常有抗性基因（如抗氨芐青霉素基因），如在培養(yǎng)基中加入一定量的氨

24、芐青霉素（選擇培養(yǎng)基），由于非工程菌的其他雜菌都沒有抗性，所以在劃線后只有存在抗性基因的工程菌能生存下來。因此，用這一方法可以篩選高表達(dá)能力的工程菌的菌株。涂布分離法（自主學(xué)習(xí)）劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更容易分開，但操作復(fù)雜些。細(xì)菌的兩種分離法各有優(yōu)點，都可采用。,4.菌落觀察細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而濕潤,有粘稠性,多數(shù)透明或半透明,但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有皺褶的。放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌

25、落表面是緊密的絨狀、堅實多皺，長孢子后就成粉末狀。由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌絲可深入到培養(yǎng)基內(nèi)，菌落不易用接種環(huán)或接種針挑動。酵母菌菌落類似于細(xì)菌菌落，表面光滑,而濕潤，有粘稠性，但大多呈乳白色（少數(shù)呈紅色）；酵母菌落為絨毛狀，孢子有各種顏色，容易區(qū)分。 如果菌落無法辨認(rèn),只有借助于顯微鏡觀察。在顯微鏡下，細(xì)菌（在高倍鏡下才能看到）一般為桿狀、球狀和弧狀；放線菌菌絲是沒有橫

26、隔的分枝絲狀體，氣生菌絲頂端分裂成串狀孢子，孢子絲有直線形、螺旋狀、彎曲式或輪生等；酵母有卵圓形或絲狀，但卵圓形細(xì)胞大于細(xì)菌；霉菌以菌絲組成菌絲體，菌絲結(jié)構(gòu)和絲狀酵母的菌絲相似。,染色法,革蘭染色 Gram stain：由丹麥細(xì)菌學(xué)家革蘭(Hans Christian Gram)創(chuàng)建的一種鑒別染色法。采用4 種試劑分4 步： 結(jié)晶紫 碘液 95%乙醇 復(fù)紅

27、（初染） （媒染） （脫色） （復(fù)染） 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 （菌體為紫色 ） （ 菌體為紅色）,,,,,,,革蘭陽性菌 革蘭陰性菌,四.設(shè)備、用品及材料：自主學(xué)習(xí)：P21-22五.實驗步驟: 1.在兩個250ml的三

28、角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基(剛配好,尚未凝固),加上封口膜。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好,放入滅菌鍋內(nèi),1kg壓力滅菌15min。 2.滅菌后,待高壓鍋或滅菌鍋壓力與大氣壓相同時(即沒有壓力了)打開鍋蓋。自主學(xué)習(xí)：P22-23,3.將大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角瓶放在左手中,靠近酒精燈火焰;右手拿著接種環(huán),并用右手無名指和小指夾住斜面的棉塞和三角瓶封口膜(請看P23圖2)。將接種環(huán)在

29、火焰上燒紅,再深入到斜面,使環(huán)接觸培養(yǎng)基冷卻后,再取菌體。將菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中,將三角瓶的封口膜和斜面的棉塞復(fù)原。三角瓶在370C搖床震蕩培養(yǎng)12h。 4.劃線分離。在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)，將搖床上培養(yǎng)12h的菌液打開，,接種環(huán)部分深入到菌液中。然后，在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線（請看P23圖3），接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次。劃線后蓋好培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下面），放到370C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12

30、~24h后，可看到在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明菌已被分離。 5.在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出,再用劃線法接種在斜面上, 370C培養(yǎng)24h后， 40C冰箱保存。,課堂反饋：請根據(jù)所學(xué)知識回答以下問題: （1）有2位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下2種統(tǒng)計結(jié)果：甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230；乙同學(xué)在該濃度下涂布了3個

31、平板統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，并且取平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果；請評價這兩位同學(xué)的實驗結(jié)果的有效性①甲同學(xué) ，原因是 。②乙同學(xué) ，原因是 。,不合理,沒有設(shè)置重復(fù)組，結(jié)果不具有說服力,不合理,1個計數(shù)結(jié)果與另2個相差太遠(yuǎn)（或在操作

32、過程中可能出現(xiàn)錯誤，或只簡單地計算了平均值）,③正確做法是 。 ④稀釋涂布平板法所用培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分屬于哪一種 培養(yǎng)基；⑤倒平板前保證培養(yǎng)基無雜菌的常用方法是,,,在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少3個平板作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實驗結(jié)果時，一定要考

33、慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否相當(dāng)，結(jié)果差距太大，意味著操作有誤，需要重新實驗。,固體培養(yǎng)基,用高溫蒸汽滅菌,（2）生物工程常需分離酵母菌和Taq耐熱菌，分離方法常用選擇培養(yǎng)基。例如用加高濃度食鹽的適宜培養(yǎng)基，分離金黃色葡萄球菌。請?zhí)岢鰪暮?xì)菌、酵母菌和Taq耐熱菌的培養(yǎng)液中分離酵母菌和Taq耐熱菌的方案。⑥分離酵母菌 ⑦分離Taq耐熱菌