喹賽多對大腸桿菌的抗菌作用研究.pdf

1、喹賽多是新一代喹噁啉類的抗菌促生長藥物，因其抗菌促生長作用顯著、毒副作用低、使用范圍廣而倍受關(guān)注，關(guān)于喹賽多的抗菌機理目前還沒有研究。通過對喹賽多抗菌機理的研究有助于進一步闡明喹噁啉類藥物的抗菌作用方式，加快喹噁啉類藥物的研發(fā)速度，為喹噁啉類藥物的合理、安全使用提供理論依據(jù)。本實驗選取對喹賽多最敏感的大腸桿菌C84010作為實驗菌種，研究表明，喹噁啉類藥物作用于細菌后可以損傷細菌的DNA并抑制DNA的合成，具有顯著的厭氧選擇活性，并在細

2、菌內(nèi)還原活化產(chǎn)生自由基。目前尚未確定喹噁啉類藥物在抗菌作用中所產(chǎn)生的自由基種類，其是否有作用靶點尚不清楚。本實驗將分別在有氧和厭氧條件下對喹賽多作用大腸桿菌后細菌內(nèi)產(chǎn)生的自由基進行檢測，研究各種自由基在喹賽多抗菌過程中的作用，并對藥物作用后細菌的形態(tài)變化和DNA損傷進行研究，找到喹賽多作用的主要方式和靶點。藥物與受體的結(jié)合是藥物的作用方式之一，大腸桿菌內(nèi)是否存在喹賽多抗菌作用的受體目前還沒有研究，本實驗將采用放射性標記的方法對大腸桿菌內(nèi)

3、是否存在喹賽多作用受體進行研究。
　　 1.自由基在喹賽多抗菌作用中的功能研究
　　 本實驗將分別在有氧和厭氧條件下對喹賽多及其代謝物的抗菌活性進行研究，并對喹賽多代謝過程中產(chǎn)生的自由基進行檢測，確定自由基在其抗菌過程中的作用。并對喹賽多作用后細菌的DNA損傷進行研究，確定自由基和DNA損傷的關(guān)系，同時實驗將對喹賽多作用后細菌細胞膜損傷和形態(tài)學(xué)變化進行研究。
　　 喹賽多(CYA)在厭氧條件下對大腸桿菌C8401

4、0的MIC和MBC分別為1、4μg/ml，在有氧條件下的MIC和MBC分別為16、128μg/ml，這說明喹賽多和其他喹噁啉類藥物一樣具有明顯的厭氧選擇活性。對其代謝物Cy10、Cy2、Cy1、Cy17、CY6的MIC測定發(fā)現(xiàn)，只有代謝物Cy17(MIC=1μg/ml)具有抗菌活性，而兩種脫一氧產(chǎn)物(CY10、CY2)和一種脫二氧產(chǎn)物(CY1)都沒有抗菌活性，這說明喹賽多1和4號位上的N→O基團是喹賽多抗菌作用的必要條件。在有氧條件下，

5、在喹賽多處理的細菌培養(yǎng)基上清液中檢測到了CYA、CY10、CY2，沒有檢測到CY1；在厭氧條件下，培養(yǎng)基上清液中檢測到了CYA、CY10、CY2、CY1；無論是在有氧或是厭氧條件下都在細菌體內(nèi)檢測到了CYA、CY10、CY2、CY1。這說明無論在有氧還是厭氧條件下，喹賽多都可以進入細菌內(nèi)發(fā)生脫氧代謝產(chǎn)生脫一氧和脫二氧代謝產(chǎn)物。
　　 在厭氧條件下，經(jīng)0.5MIC、MIC、MBC濃度的喹賽多作用后的細菌內(nèi)均有一定量的ROS產(chǎn)生，其

6、產(chǎn)生量隨著藥物濃度的增加而增加，在1h時ROS的產(chǎn)生量達到最大。在有氧條件下，經(jīng)0.5MIC、MIC、MBC濃度的喹賽多處理的細菌內(nèi)均有一定量的超氧自由基產(chǎn)生，其隨著藥物濃度和時間的增加顯著上升，4h時超氧自由基的量可以達到0h時的16倍左右。經(jīng)有抗菌活性的代謝物Cy17作用后細菌體內(nèi)產(chǎn)生了和喹賽多大致等量的超氧自由基，而其他代謝物(CY10、CY2、CY1、CY6)作用后細菌內(nèi)無超氧自由基產(chǎn)生。在厭氧條件下，經(jīng)0.5MIC、MIC、M

7、BC濃度的喹賽多作用后細菌內(nèi)并沒有羥自由基的產(chǎn)生。
　　 在厭氧條件下，自由基清除劑甘露醇、硫脲、二甲亞砜、丙酮、β-巰基乙醇、乙醇、甲醇、疊氮化鈉都可以一定程度抑制喹賽多的抗菌作用，這說明自由基在喹賽多抗菌過程中起到了很重要的作用。在有氧條件下，鈦試劑對0.5MIC、MIC、MBC濃度的喹賽多的抗菌作用都有較強的抑制作用，隨著鈦試劑濃度的增加抑制作用增強，這說明在有氧條件下超氧自由基在喹賽多抗菌作用中發(fā)揮著很重要的作用。不同濃

8、度喹賽多作用含質(zhì)粒pUC-19的大腸桿菌2h后，細菌內(nèi)質(zhì)粒出現(xiàn)了明顯的降解，降解作用隨著時間的延長和藥物濃度的增加逐漸增強。β-巰基乙醇和疊氮化鈉可以顯著的抑制喹賽多對質(zhì)粒的損傷作用，這說明喹賽多很可能是以芳香族自由基的形式作用于DNA核糖上的C1位引起了DNA的降解。
　　 經(jīng)0.5MIC、MIC、MBC濃度的喹賽多作用后細菌的細胞膜并沒有出現(xiàn)明顯的損傷。通過掃描電鏡觀察在厭氧條件下喹賽多作用的細菌形態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.5MIC、M

9、IC、MBC濃度的喹賽多作用0.5h后細菌的形態(tài)變化都不是很明顯，為正常的短桿菌狀。在MIC濃度作用4h后，細菌明顯變長；24h后，細菌呈現(xiàn)長條狀；48h后，細菌出現(xiàn)了絲狀，部分細菌出現(xiàn)了斷裂、破碎、細胞質(zhì)外泄等癥狀。這種細菌出現(xiàn)了變長、絲狀的反應(yīng)是細菌DNA受到損傷時的特有反應(yīng)。
　　 2.喹賽多在細菌體內(nèi)結(jié)合位點的研究
　　 目前，還沒有對喹噁啉類藥物作用相關(guān)受體進行研究的報道，本實驗將采用放射性標記的方法研究細菌內(nèi)

10、是否存在喹賽多作用受體。實驗將從兩個方面進行研究：第一，先將細菌的亞細胞片段進行分離，使用放射性透析法研究氚標記喹賽多是否和亞細胞組分有結(jié)合；第二，用不同濃度的氚標記喹賽多處理大腸桿菌，觀察亞細胞組分是否會出現(xiàn)受體飽和現(xiàn)象。
　　 本實驗利用差速離心法建立了細菌細胞壁、細胞膜、細胞漿的分離方法。不同的亞細胞組分在0.01、0.1、1μg/ml的氚標記喹賽多中透析20h以后，透析袋內(nèi)外放射性比值基本都在1左右，這說明藥物并沒有和細

11、菌的各亞細胞組分產(chǎn)生特異性結(jié)合。對氚標記喹賽多處理的細菌進行亞細胞組分分離，發(fā)現(xiàn)喹賽多在細胞壁、細胞膜和細胞漿中的分布比例分別為5.89%、16.22%和77.8%，說明藥物主要分布于細胞漿中。藥物濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16μg/ml的喹賽多作用于細菌不同時間后，使用抽濾法對結(jié)合于各種亞細胞組分中放射活度進行了檢測，發(fā)現(xiàn)各種亞細胞組分中的放射性并沒有隨著藥物濃度的增加出現(xiàn)放射性受體飽和現(xiàn)象，這說明喹賽多進入

12、細菌后并沒有和各亞細胞組分進行特異性的結(jié)合。
　　 綜上所述，喹賽多和其他喹噁啉藥物一樣具有顯著的厭氧選擇活性：在有氧條件下，喹賽多作用后細菌內(nèi)產(chǎn)生了超氧自由基，超氧自由基是喹賽多發(fā)揮抗菌作用的重要因素之一；在厭氧條件下，喹賽多作用后細菌內(nèi)產(chǎn)生了一定量的ROS，沒有羥自由基的產(chǎn)生，喹賽多代謝形成的自由基造成的細菌DNA損傷是喹賽多抗菌作用的原理之一；喹賽多可以引起細菌形態(tài)的明顯改變；喹賽多在抗菌作用過程中在細菌體內(nèi)并沒有特定的受