發(fā)酵過程控制

1、發(fā)酵工程 課件 Fermentation Engineering,第五章 發(fā)酵過程控制(二),主講人：夏帆,歡迎,光臨,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,2,教學(xué)目的：了解發(fā)酵過程pH變化的原因；掌握pH對發(fā)酵的影響；掌握pH的控制策略。 教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：pH對發(fā)酵的影響；pH的控制策略，特別是如何分階段控制pH。,第2節(jié) 發(fā)酵過程的pH控制(2學(xué)時(shí)),2024年3月23日星

2、期六,3,內(nèi) 容 速 覽,,二、pH對發(fā)酵的影響,一、發(fā)酵過程pH變化的原因,,,,四、pH的控制策略,,pH控制,1、調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的初始pH2、在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)3、通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH 4、當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH 5、不同調(diào)pH方法的影響6、發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值,,,三、pH測量,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,4,不同種類微生物，對pH要求不同；,,酵 母：

3、pH 3.8－6.0,細(xì) 菌：pH 6.5－7.5,霉 菌：pH 4.0－5.8,放線菌：pH 6.5－8.0,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,5,同種微生物對pH變化的反映不同,,pH 3.5－5.0 生長良好，不易染菌；,pH >5.0時(shí)，易染細(xì)菌；,pH <3.0時(shí)，生長受抑制，易自溶；,如，石油代蠟酵母,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,6,,一、發(fā)酵過程引起pH變化的原

4、因,1、基質(zhì)代謝,2、產(chǎn)物形成,3、菌體自溶,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,7,,1、基質(zhì)代謝,（1）糖代謝 特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一。（2）氮代謝 當(dāng)氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升；NH3利用后pH下降；當(dāng)碳源不足時(shí)氮源當(dāng)碳源利用pH上升。（3）生理酸性物質(zhì)、生理堿性物質(zhì) 利用后pH會下降或上升。,

5、2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,8,2、產(chǎn)物形成,某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機(jī)酸類產(chǎn)生使pH下降紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。,3、菌體自溶，pH上升；發(fā)酵后期，pH上升。,,一、發(fā)酵過程引起pH變化的原因,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,9,(1)下降①培養(yǎng)基中C/N不當(dāng)，有機(jī)酸積累；②消沫油加得過多；③生理酸性物質(zhì)過多；(2)上升①

6、C/N比例不當(dāng)，N過多，氨基氮釋放；②生理堿性物質(zhì)過多；③中間補(bǔ)料時(shí)堿性物加入量過大；,引起發(fā)酵液pH值變化的常見因素,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,10,,例1 pH對林可霉素發(fā)酵的影響,林可霉素發(fā)酵開始，葡萄糖轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸類中間產(chǎn)物，發(fā)酵液pH下降，待有機(jī)酸被生產(chǎn)菌（林可鏈霉菌）利用，pH上升。（如下頁圖所示） 若不及時(shí)補(bǔ)糖、(NH4)2SO4或酸，發(fā)酵液pH可迅速升到8.0以上，阻礙或抑制

7、某些酶系，使林可霉素增長緩慢，甚至停止。,1、實(shí)例,,,,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,11,林可霉素（潔霉素）,對革蘭陽性球菌有較好作用，特別對厭氣菌、金葡菌及肺炎球菌有高效。作用機(jī)制：主要抑制細(xì)菌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成 臨床：主要用于敏感菌引起的各種感染，如肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、蜂窩織炎、扁桃體炎、丹毒、癤及泌尿系統(tǒng)感染等。 可進(jìn)入骨組織中，和骨有特殊親和力，故特別適用于厭氣菌引起的感染及金葡菌性骨髓炎。,

8、,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,12,pH對林可霉素發(fā)酵的影響,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,13,對照罐發(fā)酵66小時(shí)pH達(dá)7.93，以后維持在8.0以上至115小時(shí)，菌絲濃度降低，NH2-N升高，發(fā)酵不再繼續(xù)。 發(fā)酵15小時(shí)左右，pH值可以從滅菌后的6.5左右下降到5.3，調(diào)節(jié)這一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高發(fā)酵單位。,pH對林可霉素發(fā)酵的影響,2024年

9、3月23日星期六,14,例2：培養(yǎng)基初始pH值對漆酶分泌的影響,pH在5～7范圍內(nèi)產(chǎn)酶最高,,,,（三色革裥菌）,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,15,,2、pH對發(fā)酵的影響,（2）pH影響酶的活性,（3）pH值影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的改變,（4）pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離,（1）影響菌體的生長,（5）pH影響代謝方向,（6）影響產(chǎn)物穩(wěn)定性,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,1

10、6,舉例：產(chǎn)黃曲霉的細(xì)胞壁的厚度就隨pH值的增加而減?。浩渚z直徑在pH6.0時(shí)為2～3 μm；pH7.4時(shí)為2～18 μm，并呈膨脹酵母狀；pH值下降后菌絲形態(tài)又會恢復(fù)正常。,（1）影響菌體的生長,,2、pH對發(fā)酵的影響,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,17,,2、pH對發(fā)酵的影響,（2）pH影響酶的活性 當(dāng)pH值抑制菌體某些酶 的活性時(shí)使菌的新陳代謝受阻。,（3）pH值影響微生物細(xì)胞膜所帶電

11、荷的改變 從而改變細(xì)胞膜的透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進(jìn)行。,（4）pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離 從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用 。,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,18,（5）pH影響代謝方向 pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。例如黑曲霉在pH2~3時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在pH近中性時(shí)，

12、則產(chǎn)生草酸。 谷氨酸發(fā)酵，在中性和微堿性條件下積累谷氨酸，在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。,,2、pH對發(fā)酵的影響,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,19,pH不同，微生物代謝產(chǎn)物不同。,,黑曲霉,pH：2－3，檸檬酸 發(fā)酵,pH：7.0，草酸發(fā)酵,,谷氨酸菌,pH：7－8，GA發(fā)酵,pH：5.0－5.8，谷氨酰胺發(fā)酵,,釀酒酵母,pH：4.5-5.0－3，乙醇 發(fā)酵,pH：8.0，

13、甘油發(fā)酵,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,20,β-內(nèi)酰胺抗生素噻納霉素的發(fā)酵中，pH在6.7～7.5之間時(shí)抗生素的產(chǎn)量相近，高于或低于這個(gè)范圍，合成受到抑制。在這個(gè)pH值范圍內(nèi)，噻納霉素的穩(wěn)定性未受到嚴(yán)重影響；但pH>7.5時(shí)，穩(wěn)定性下降，半衰期縮短，發(fā)酵單位也下降。青霉素在堿性條件下發(fā)酵單位低，也與青霉素的穩(wěn)定性有關(guān)。,（6）影響產(chǎn)物穩(wěn)定性,,2、pH對發(fā)酵的影響,21,,3、pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有

14、不同的影響,pH對菌體生長影響比產(chǎn)物合成影響小,四環(huán)素：菌體生長最適pH6.0~6.8，產(chǎn)物合成最適 pH5.8~6.0 。青霉素：菌體生長最適pH3.5~6.0，產(chǎn)物合成最適 pH7.2~7.4 。,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,22,,,4、最佳pH的確定,配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶考察發(fā)酵情況,pH對產(chǎn)海藻酸裂解酶的影響,2024年3

15、月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,23,pH對海藻糖水解酶產(chǎn)生的影響,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,24,pH對谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活力的影響,菌體干重(g/L),,,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,25,三、pH測量,1、取樣罐外測量,試紙法 （精密級）酸度計(jì)法,罐外取樣測量不利于實(shí)現(xiàn)自動化管理,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,26,2、在線測量,發(fā)酵用復(fù)合p

16、H電極 + pH顯示儀表,pH測量原理圖,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,27,發(fā)酵用復(fù)合pH電極,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,28,發(fā)酵用復(fù)合pH電極要求,?能高溫滅菌，過高的溫度將對玻璃膜材質(zhì)和參比電極性質(zhì)產(chǎn)生影響，造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞。,?具有長時(shí)間的穩(wěn)定性，應(yīng)保證轉(zhuǎn)換系數(shù)和不對稱電位能適應(yīng)發(fā)酵周期長、中途不能更換和不能標(biāo)定的要求,? 外加不銹鋼護(hù)套或工程塑料護(hù)套后安裝于罐內(nèi),

17、?要求一定的液絡(luò)部流通，維持的液接界電位穩(wěn)定，防止使用過程中液絡(luò)部被含硫物、蛋白質(zhì)和非水溶液污染，造成電極測量漂移,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,29,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,30,pH顯示儀表,應(yīng)具有較高的輸入阻抗（1011-1012 ?）并具有自動或手動的溫度補(bǔ)償功能,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,31,1、調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的初始pH 基礎(chǔ)料中若

18、含有玉米漿，pH呈酸性，必須調(diào)節(jié)pH。若要控制滅菌后pH在6.0，滅菌前pH往往要調(diào)到6.5~6.8。,2、在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)如CaCO3 ，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等。,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,32,在發(fā)酵過程中根據(jù)糖氮消耗需要進(jìn)行補(bǔ)料。在補(bǔ)料與調(diào)pH沒有矛盾時(shí)采用補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH。如（1）調(diào)節(jié)補(bǔ)糖速率，調(diào)節(jié)空氣流量來調(diào)節(jié)pH。 (2) 當(dāng)NH2-N低，pH低時(shí)補(bǔ)氨水；

19、 當(dāng)NH2-N低，pH高時(shí)補(bǔ)(NH4)2SO4。 通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH值既調(diào)節(jié)了培養(yǎng)液的pH值，又可補(bǔ)充營養(yǎng)，進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)率。,4、當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH,3、通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,33,應(yīng)急措施：改變攪拌轉(zhuǎn)速或通氣量，以改變?nèi)芙庋鯘舛龋刂朴袡C(jī)酸的積累量及其代謝速度；改變溫度，以控制微生物代謝速度；改變罐壓及通氣量，降低CO2的溶解量；

20、改變加油或加糖量等，調(diào)節(jié)有機(jī)酸的積累量；,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,34,分別在4種緩沖介質(zhì)中，于pH 6.50一9.50測定天冬酰胺酶酶活力。1 甘氨酸介質(zhì)在pH8.0 時(shí)酶活力最高；2 硼酸在pH8.50，酶活力最高；3 磷酸在pH 8.50，酶活力最高；4 Tris在pH 8.50，酶活力最高；酶活1＞2＞4＞3,5、不同調(diào)pH方法的影響,天冬酰胺酶,pH,三羥甲基氨基甲烷,35,

21、“1”——CaC03 “2”——尿素 “3”——CaC03+尿素,不同pH控制方式對目的突變株ISw330異亮氨酸搖瓶發(fā)酵的影響,黃色短桿菌誘變,36,例：pH對L-異亮氨酸發(fā)酵的影響（天津科技大學(xué)，2004）,菌株最適生長pH控制在6.8～7.0,6、發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,37,不同pH值對菌體的形態(tài)影響很大，當(dāng)pH值高于7.5時(shí)，菌體易于老化，呈現(xiàn)球狀；當(dāng)p

22、H值低于6.5時(shí)菌體同樣受抑制，易于老化。在6.9左右時(shí)，菌體處于生長期，呈“八”字形狀并占有絕對的優(yōu)勢；而在7.2左右時(shí)，菌體是處于產(chǎn)酸期，呈現(xiàn)長的橢圓形。,38,pH6.9時(shí)，菌體生長旺盛，pH7.15時(shí)，對菌體的產(chǎn)酸有利。采用階段pH控制模式進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值為7.15，到80h后pH值為7.25。產(chǎn)率22.27g/L，產(chǎn)酸率提高11.2５％。,,,,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生

23、物工程系,39,例：克拉維酸(CA）發(fā)酵中pH變換控制,問題的提出： CA產(chǎn)生菌棒狀鏈霉菌在pH低時(shí)生長受抑制，在pH高時(shí)克拉維酸要分解。,用2.5升罐進(jìn)行的不控制pH的發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，前期由于微生物產(chǎn)生的酸性副產(chǎn)物和有機(jī)酸使pH降至6.5。在達(dá)到最高細(xì)胞濃度后，pH開始從6.5升至8.3。產(chǎn)量達(dá)最高水平時(shí)，pH不再升高。在發(fā)酵終止時(shí)，pH再次升至8.5。隨著pH升高，CA迅速分解。,國外醫(yī)藥抗生素分冊，2004年第1期,,2024年3月23

24、日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,40,克拉維酸,廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑 僅有微弱的抗菌活性 ，單獨(dú)應(yīng)用無效 可使不耐β—內(nèi)酰胺酶的抗生素如青霉素G、氨芐西林、阿莫西林或頭孢菌素Ⅱ(頭孢噻吩)的抗茵譜增廣，抗菌活性增強(qiáng) 金葡菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、流感桿菌及脆弱桿菌等,,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,41,pH控制對細(xì)胞量和CA產(chǎn)量的影響研究,控制 pH6.0時(shí)，細(xì)胞生長受抑制

25、，CA產(chǎn)生完全被抑制，產(chǎn)量很小。,分別控制pH為6.0，7.0，8.0測定菌的生長和產(chǎn)物合成。,取發(fā)酵液10 mL于離心沉淀管中,在3500r/min下離心l0min, 測沉淀物在發(fā)酵液中的比例即得菌絲濃度,42,pH8.0時(shí)，生長良好，產(chǎn)量稍有下降，但CA分解更快。,pH7.0時(shí)，細(xì)胞和CA都很高，但仍出現(xiàn)CA迅速分解。,CA,細(xì)胞,產(chǎn)物,細(xì)胞,,,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,43,控制pH7.0和8.0時(shí)，

26、最高細(xì)胞濃度接近相同(約16％PMV)，但控制pH6.0時(shí)細(xì)胞生長受抑制。 在2.5升生物反應(yīng)器內(nèi)：不控制pH時(shí)，最高產(chǎn)率2.47μg／(m1·h )；控制pH7.0時(shí)，最高產(chǎn)率3.37μg／(m1·h)； 控制pH8.0時(shí)，最高產(chǎn)率2.02μg／(m1·h)； 在控制pH6.0時(shí)，CA產(chǎn)生被抑制，但降解少。 因此對細(xì)胞生長和CA產(chǎn)生最好將pH控制于7.0，但在控制pH7.0時(shí)，仍出現(xiàn)

27、CA的迅速分解。,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,44,由于CA生產(chǎn)的最適pH和減少CA分解的pH各不相同，因此在分批發(fā)酵中應(yīng)用pH變換策略來控制。,在發(fā)酵前期，在細(xì)胞生長和產(chǎn)生CA期間控制pH7.0，4d后，當(dāng)CA產(chǎn)量達(dá)最高值時(shí)，變換pH為6.0，以減少CA分解。最高CA濃度可保持24h。由于改變pH，使CA分解速率明顯降低。,2024年3月23日星期六,長江大學(xué)生科院生物工程系,45,1、發(fā)酵過程中pH會不會發(fā)