體外分析核醫(yī)學2016全解

1、第六章 體外分析,深圳大學第一附屬醫(yī)院 核醫(yī)學科 申群喜,,,待測物質濃度與檢測手段,臨床化學分析,,,,,,,pg/L,ng/L,mg/L,mg/L,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,,,,,,,,,常量,微量,

2、超微量,,,定 義：,利用放射分析方法或其派生的相關技術，測定生物樣品中微量生物活性物質含量檢測：激素 腫瘤標志物 藥物濃度 受體,分 類：,Click to add title in here,4,2,3,體外分析技術,體外放射分析,體外非放射分析,放射性競爭結合分析,放射性非競爭結合分析,放射免疫分析*,(IRMA),免疫放射分析*,酶免疫分析,(EIA),化學發(fā)光免疫分析,(CLIA),熒光免疫分析,

3、,,,,,,,,,,,(FIA),(RIA),膠體金標記分析 (CGIA),第一節(jié) 放射免疫分析 Radioimmunoassay, RIA,Ag,Ab,,,+,Ag-Ab,環(huán) 境 因 素： 離子強度 生理鹽水或緩沖液 酸 堿 度 pH6-pH9, pH7左右 溫 度 15℃-40 ℃ ,37 ℃最適,抗原抗體特異性結合反應,

4、一. RIA基本原理*,討論簡單化，假定的“理想模式”： 抗原和標記抗原對抗體具有完全相同 的免疫活性2. 抗體只有一種抗原結合位置 1+1=1反應3. 反應符合質量作用定律 Ag+Ab AgAb,一. RIA基本原理*,,,,V1,V2,[AgAb],[Ag] [Ab],K=,一. RIA基本原理*,（一）競爭抑制免疫結合反應：體外條件下 過量的放射性標記抗原（*Ag）與

5、非標記抗原（即待測抗原，Ag）同時與限量的特異性抗體（Ab）進行競爭抑制免疫結合反應 （三種成份）,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,,,+,*Ag-Ab,(B),(F),+ *Ag（過量部分）,*Ag:標記抗原 Ag:非標記抗原 Ab:特異性抗體*Ag-Ab:標記的抗原-抗體復合物 Ag-Ab:非標記的抗原-抗體復合物,一. RIA基本原理*,一. RIA基本原理*,RIA原理示意圖,,,一. RIA基本

6、原理*,（二） 劑量反應曲線/標準曲線： 定量基礎： *Ag-Ab的量（因變量）與Ag的量（自變量）之間存在競爭性抑制數(shù)量關系函數(shù)關系：二次函數(shù)關系 用標準競爭抑制曲線（簡稱標準曲線）替代,一. RIA的基本原理*,標準曲線的制備,一. RIA基本原理*,標準曲線,一. RIA基本原理*,標準曲線(CG),（三）未知樣品的檢測:同等條件下 待測抗原+過量的標記抗原+限量的特異性抗體 溫育

7、分離B和F 測量放射性活度 查標準曲線求出濃度,一. RIA基本原理*,一. RIA基本原理*,未知樣品的檢測,,,,[Ag],未知樣品的檢測,一. RIA基本原理*,完整的試劑盒（商品化）包括： 1. 抗體 2. 標記抗原 3. 標準抗原 4. 質控品 5. 沉淀劑,二. RIA基本試劑,（一）抗體（Antibody,Ab） IgG類 “三高”: 1 親和力 以親和

8、常數(shù)K表示 2 特異性 以交叉反應率表示 3 滴度 以抗體最適稀釋度表示,二. RIA基本試劑,,[AgAb],[Ag] [Ab],K=,抗體的制備： 多克隆抗體 免疫動物所得抗血清 單克隆抗體 雜交瘤技術所得抗體,二. RIA基本試劑,（二）標記抗原（* Antigen,*Ag）抗原分子中一個或數(shù)個原子被放射性核素所取代 標記的放射性核素有3H 14C 125I等

9、 125I 比活度高 半衰期合適（60天） 利用酪氨酸的“嗜碘性”標記,二. RIA基本試劑,（二）標記抗原（* Antigen,*Ag） 要求： 1. 同質性 2. 高放射性比活度（kBq/ug) 3. 放射化學純度 >95% 4. 免疫活性高,二. RIA基本試劑,（三）標準抗原（標準品）高濃度的純品物質化學標準品 結構清楚

10、物理化學方法可測定 質量單位(ng/L)生物標準品 不能用物理化學方法測定 采用與 被測物質相似分子形式的物質 生物單位(mIU/L)要求：1. 均質性 2. 純度高 3. 定量準確,二. RIA基本試劑,（四）待測樣品血漿 血清 體液 組織液要求：符合放射性檢測方法的要求

11、 去除可能存在的干擾成份,二. RIA基本試劑,（五）檢測儀器γ計數(shù)儀：125I 檢測γ射線閃爍計數(shù)器：3H或者14C 檢測β射線,二. RIA基本試劑,（一）理想的分離方法： 1. 完全分離 2. 不影響反應的平衡 3. 不受外界或其它試劑的干擾 4. 操作簡便 重復性好 5. 來源方便 價格低廉,三. RIA分離方法,（二）常用分離方法的比較：分離方法 優(yōu)

12、 點 缺 點,三. RIA分離方法,分離快 適用于任何溫育體積 沉淀易于觀察 便宜組分介質及損傷組分的分析 新方法的研究和建立分離快，適用于任何溫育體積，蛋白質含量較低的分離介質蛋白質濃度影響小，通用，特異性高，分離完全分離快，簡易，適用于大批樣品的檢測,條件不易掌握，分離不完全，對蛋白質敏感點樣量少

13、，不能處理大量樣品，測定體積受限，特殊設備對蛋白質濃度、離子強度及PH都敏感，沉淀不穩(wěn)定二抗價格高、流程長，二次溫育可能建立新的平衡依賴商品供應，抗體用量大，價高，固相抗體貯存不穩(wěn)定,活性炭吸附法電泳法沉淀法雙抗體法固相法,,,,（一）誤差的種類： 1. 系統(tǒng)誤差 確定的原因 :儀器設備 試劑質量 標準曲線擬合方式等

14、 結果：傾向性偏高或偏低 以“準確度”(accuracy)表示 2. 隨機誤差 難以確定的原因：放射性測量的統(tǒng)計 漲落 探測儀器不穩(wěn)定等 結果：雙向性 以“精密度”(percis

15、ion)表示,四. RIA質量控制,（二）精密度與準確度的區(qū)別與聯(lián)系,四. RIA質量控制,甲 乙 丙 丁,甲：即準確又 乙：不準確， 丙：尚準確， ?。杭床粶蚀_ 精密

16、 但精密 但不精密 也不精密,1 零標準管結合率（B0%） 30%-50%2 非特異性結合率（NSB%）<5%-10%3 室內質控圖 制作及質控規(guī)則,四. RIA質量控制,（三）室內質量控制,（四）室間質量控制,第二節(jié) 免疫放射分析 Immunoradiometric assay, IRMA,一.

17、IRMA基本原理*,（一）非競爭性免疫結合反應：體外條件下 過量的放射性標記抗體（*Ab）與非標記抗原（Ag）進行非競爭性免疫結合反應 （二種試劑 ）,*Ab,+,Ag-*Ab + *Ab,Ag,（B）,（F）,,,（二） 劑量反應曲線/標準曲線： 定量基礎： Ag- * Ab的量（因變量）與Ag的量（自變量）之間存在正相關的函數(shù)關系 用標準結合曲線（簡稱標準曲線）替代,一. IRM

18、A基本原理*,標準曲線的制備,一. IRMA基本原理*,IRMA標準曲線的制備,一. IRMA基本原理*,RIA標準曲線的制備,,,B%,,標準曲線,一. IRMA基本原理*,B%,,B%,,,,,IRMA的標準曲線,RIA的標準曲線,一. IRMA基本原理*,二. IRMA常用方法,雙抗夾心法 (double antibody sandwich method)2.標記第三抗體法(labeled third antibody m

19、ethod)3.雙標記抗體法(double labeled antibody method),優(yōu)點：l   反應動力學：非競爭性 且抗體過量 容易達到平衡 溫度變化對結果影響不大。 l   靈敏度：比RIA高出10～100倍。l   加樣誤差少：加樣誤差主要來自抗原一個環(huán)節(jié)缺點：l  需要特殊的分離方法。 l 

20、 對半抗原不適應l  要大量的*Ab，昂貴,三. IRMA優(yōu)缺點,四. IRMA與RIA主要區(qū)別*,第三節(jié) 非放射免疫分析技術,1 酶標記免疫分析技術2 化學發(fā)光免疫分析技術 3 時間分辨熒光免疫分析技術4 膠體金標記分析技術,一 酶標記免疫分析技術（enzyme immumoassay,EIA) 酶分子代替放射性核素 標記抗原或抗體的免疫分析的技術 結合了抗原抗體高特異性和酶促反應的高敏感

21、性。常見方法為ELISA。 常用的酶為辣根過氧化物酶 底物是四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) ，反應后顯黃色。,二 化學發(fā)光免疫分析技術(CLIA) 以化學發(fā)光物質代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術。 1 化學發(fā)光免疫分析 吖啶酯2 化學發(fā)光酶免疫分析 金剛烷3 電化學發(fā)光免疫測定 三聯(lián)吡啶釕,三 時間分辨熒光免疫分析技術（time-resolved fluoroimmunoassay

22、，TRFIA）,采用稀土元素標記抗體，利用時間分辨熒光儀特定的延遲時間測量，獲得稀土元素的特異熒光信號，同時消除非特異性熒光物質的干擾。,四 膠體金標記分析技術技術（colloidal-gold immunoassay，CGIA）,采用膠體金為標記物，利用氯金酸（HAuCl4)在還原劑的作用下，形成紅色的膠體狀態(tài)。,問題：,放射免疫分析反應物有幾種 ？放射免疫分析抗原通常用什么標記?免疫放射分析反應物有幾種？,[小結],掌握:

23、 1.放射免疫分析的原理 、方法 及質量控制 2.免疫放射分析的原理熟悉: 放射免疫分析質量控制,思考題：,1. 簡述放射免疫分析的基本原理及方法。2. 如何利用RIA方法檢測待測物？3. 簡述免疫放射分析的基本原理及方法。4. 放射免疫與免疫放射分析有何區(qū)別？,參考書：,1.核醫(yī)學，第七版，李少林等主編，人衛(wèi)出版社;2.核醫(yī)學，譚天秩主編；3.醫(yī)學免疫學，第五版，