正相柱還是反相柱

1、液相注意事項液相注意事項特別注意HPLC使用過后的系統(tǒng)清洗：含有緩沖鹽溶液的流動相的清洗方法：1、先用100%的純水沖洗，打開排放閥，用3~5mlmin的流量，洗二十分鐘左右后停泵。此舉主要是針對吸液系統(tǒng)、泵頭、進(jìn)出口單向閥等體積較大的空間的清洗2、再用95：5的甲醇水清洗整個系統(tǒng)，關(guān)閉排放閥，用1mlmin的流量，洗30~60分鐘后停泵。此舉主要是用水清洗整個系統(tǒng)中的鹽，用5%的甲醇主要是為了保護(hù)色譜柱。3、最后用100%的甲醇清洗整

2、個系統(tǒng)，用1mlmin的流量，洗2分鐘左右，然后關(guān)機(jī)。如果流動相中不含鹽，則使用上述第三步清洗即可。反相色譜切換正相色譜流程：1、先將色譜柱用相應(yīng)的溶劑沖洗干凈，然后將色譜柱拆下來密封保存。用雙通將進(jìn)樣器與檢測器連接。2、將貯液瓶內(nèi)裝入300ml的二次蒸餾水，將流速漸次提高到2.0mlmin沖洗系統(tǒng)1.5h。注意觀察泵壓。3、將流速漸次降到0mlmin，把二次蒸餾水更換為甲醇，，將流速漸次提高到2.0mlmin沖洗系統(tǒng)1h。4、用同樣的

3、方法將甲醇更換為異丙醇、四氫呋喃，各沖系統(tǒng)1h。5、最后將四氫呋喃更換為預(yù)先配制好的流動相沖系統(tǒng)1h，同時將柱塞桿清洗系統(tǒng)內(nèi)的10%異丙醇更換為流動相，保持5060滴min的速度清洗柱塞桿。再將雙通更換為正相色譜柱，待色譜柱平衡好以后就可分析樣品了。什么導(dǎo)致反相柱子污染產(chǎn)生？通常，樣品中含有一些對分析者來說不感興趣的東西。鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)是一些可能在使用時與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)有

4、比分析者的目標(biāo)物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質(zhì)如鹽類一般來說在空體積時就被沖出色譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強(qiáng)的保留而且流動相溶液成分不足以把這些物質(zhì)洗脫下來，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。對于典型的硅膠鍵合柱來說如果沒有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列：100％甲醇；100％乙晴；75％乙晴－25％異丙醇；10

5、0％異丙醇；100％二氯甲烷100％正己烷；用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑。每種溶劑至少沖洗10個柱體積。如250mm4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用1～2mlmin的流速來沖洗，要回復(fù)原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒有緩沖的流動相，最后回復(fù)起始流動相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴(yán)重污

6、染，可以二甲基亞砜（DMSO）或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5mlmin的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子是一個非常耗時間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作。常見液相色譜柱性能比較。最常用的“萬能柱“填料為“C18“，簡稱“ODS“柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70～80％的分析任務(wù)。由于C18(ODS

7、)是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛。近年來，為適應(yīng)氨基酸、小肽等生物分子的分析任務(wù)，又發(fā)展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（20～40μm）。反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與