世界上最完善最詳細(xì)的神經(jīng)元原代培養(yǎng)完全黃金版

1、世界上最完善最世界上最完善最詳細(xì)詳細(xì)的神的神經(jīng)元原代培養(yǎng)完全黃金版元原代培養(yǎng)完全黃金版[精華]序言：國內(nèi)外關(guān)于原代培養(yǎng)有很多文獻(xiàn)，不幸的是，沒有一篇是詳細(xì)的，沒有一篇解答過why.為了讓大家少走彎路，根據(jù)我殺過3000只老鼠的經(jīng)驗，我把我這幾年摸索的經(jīng)驗和大家分享，請求多投幾票得幾個叮當(dāng)。相信你follow我的這篇文章一定會做的很好。我的標(biāo)題說的很像吹牛，但是我是嚴(yán)肅認(rèn)真的說的，Iearnit.note:這篇文章全是我個人的經(jīng)驗，99。

2、9%原創(chuàng)，經(jīng)過無數(shù)失敗的到的最完美的原代神經(jīng)元培養(yǎng)法，除了最后那一副圖是來自下面第2行那篇文獻(xiàn)，所以我才說是99.9%原創(chuàng)。（注：附錄的圖是常用的消化酶對實驗的存活率影響，來自下面鏈接里的文獻(xiàn)）另外，成年鼠的原代培養(yǎng)我沒有摸索過，推薦一篇文獻(xiàn)在我以前的帖子（無需叮當(dāng)）（bbspostviewbid=156&id=17651341&sty=3）本篇專門討論胎鼠和新生鼠神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。1.材料選擇。一定要嚴(yán)格按照國際上，NCBI數(shù)據(jù)庫，其

3、他文獻(xiàn)的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因為新生鼠有一些受體，在培養(yǎng)的工作中失去功能，會不能再生，比如NMDA受體。和文獻(xiàn)不同會導(dǎo)致錯誤結(jié)論，甚至困惑。很多人寫信問我新生鼠的培養(yǎng)問題，我回答用新生鼠的實驗很少，八成是你自己搞錯了實驗對象，請確認(rèn)國際上的相關(guān)研究文獻(xiàn)所用老鼠，再來問我下面的問題。2，培養(yǎng)基選擇（neurbasalneurobasalainvitrogenCo.ltd)。我強(qiáng)烈不建議用血清培養(yǎng)。原因是：首

4、先，血清刺激膠質(zhì)細(xì)胞和雜細(xì)胞分裂，最后非常影響神經(jīng)元產(chǎn)量；其次，為了抑制膠質(zhì)生長，往往要加入阿糖孢苷。嚴(yán)重的毒性會影響許多靈敏實驗；再次，最重要的，血清培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)很不均一，從正常到凋亡都有，嚴(yán)重影響試驗準(zhǔn)確，而無血清專用培養(yǎng)基所有的正常細(xì)胞都處于一樣的狀態(tài)，要么都好，要么都差，高度一致。InvitrogenGIBCO無血清培養(yǎng)基neurobasal(neurbasalA)被認(rèn)為是最標(biāo)準(zhǔn)，最好的培養(yǎng)基。需要的添加劑為B27和谷氨酰胺。

5、培養(yǎng)出的細(xì)胞狀態(tài)均一，膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不分裂。其中，neurobasal是關(guān)于POLYLYS包被，我們是包被30分鐘，吸干晾過夜，然后洗兩次，或者只洗一次但是要30分鐘接著晾干。由于neurobasal培養(yǎng)法相當(dāng)成熟，所以沒必要用難固定的膠原。5.處死母鼠并把胎鼠解剖時候，一定要注意母鼠狀態(tài)，是否有死胎，胎兒胎盤是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的（一般是E16E18）這些信息也要嚴(yán)格記錄。處死孕鼠后，要立即取出子宮放入冰冷培養(yǎng)液中。注意孕

6、鼠處死后要短暫的浸泡酒精消毒，防止污染。一般來說，冰袋筆者選擇一面藍(lán)一面白的。藍(lán)的朝上，可以很清晰看到海馬結(jié)構(gòu)。而去除血管膜的時候，白的那面朝上，這樣可以很清楚看到血管膜。從處死老鼠到大腦被剝離出這段是人就會做，我就不多說了。不過有一點(diǎn)要注意，不管你是用皮層還是海馬，不要取一個分離一個，而是要快速把所有胎鼠大腦都迅速取出放到冰預(yù)冷的培養(yǎng)液中。我建議胎鼠取出來的時候胎鼠就放在冰冷的緩沖液中。就是說，處死后要迅速把大腦的溫度降到0.6：最影

7、響原代培養(yǎng)的成敗因素之一：這小段請大家一定注意看。無論皮層還是海馬，上面都是有一層血管膜。注意：一定要盡可能的去掉所有的血管和血管膜?？梢杂媒馄曙@微鏡。胎鼠很好剝離，而新生鼠則比較難。這里千萬不能粗心大意?。⊙苣]剝離干凈的后果是：1吹打時候很難吹打下來神經(jīng)元，被迫多次吹打，造成神經(jīng)元大量死亡；2血管膜一部分細(xì)胞會混入原代培養(yǎng)中，這些細(xì)胞往往會分裂，導(dǎo)致你的培養(yǎng)成果根本不能用?？梢哉f，剝離的不好不干凈，實驗就是失敗的，不可能得到高質(zhì)量

8、的神經(jīng)元。注意的事情二：如果是要的是皮層的神經(jīng)元原代培養(yǎng)，而皮層的細(xì)胞很多，切忌不要放太多皮層消化吹打！過多的細(xì)胞反而會導(dǎo)致神經(jīng)元大量死亡。另外，請仔細(xì)注意文獻(xiàn)中要的是皮層哪一部位。沒有詳細(xì)要求的話一般是取頂端。從大腦到單個海馬的剝離我不細(xì)說了。我現(xiàn)在以海馬神經(jīng)元為例。在所有海馬都成功剝離后，請仔細(xì)的去除血管膜，原因上面說過。最后，請再仔細(xì)檢查一下是不是都去掉了。確認(rèn)后，海馬片段被移入一個小燒杯里，加少量培養(yǎng)液，用剪刀剪成0.51立方毫