癌基因與抑癌基因研

1、癌基因、抑癌基因與化學(xué)致癌,,第一節(jié) 癌基因和抑癌基因,癌基因(oncogene, onc)： 是一類普遍存在于正常細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的基因，當(dāng)它受到物理、化學(xué)或病毒等生物因素的作用被“活化”而失控時(shí)，才會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。病毒癌基因細(xì)胞癌基因,（一）病毒癌基因,病毒癌基因（Virus Oncogene， v-onc）：存在于病毒基因組中的致惡性轉(zhuǎn)化基因。是病毒從宿主細(xì)胞DNA中獲得的特定細(xì)胞DNA序列，形成病毒-

2、宿主重組的產(chǎn)物。它不編碼病毒結(jié)構(gòu)成分，對(duì)病毒無復(fù)制作用，但是當(dāng)受到外界的條件激活時(shí)可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用。,1、逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因,逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，含編碼依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）基因。3個(gè)結(jié)構(gòu)基因(5’-gag--pol--env--3’) : gag--- 核心蛋白 pol---逆轉(zhuǎn)錄酶 env---病毒外殼蛋白 長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeats,

3、LTR）:含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和polyA添加信號(hào),逆轉(zhuǎn)錄病毒,前病毒：指整合到細(xì)胞DNA中，兩端帶有LTR的DNA中間體。病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄都需要經(jīng)過DNA中間體，這種DNA中間體成為前病毒 。前病毒→表達(dá)→組裝成新病毒顆粒→細(xì)胞表面出芽,逆轉(zhuǎn)錄病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的整合是復(fù)制病毒RNA的必經(jīng)階段。只有當(dāng)受感染細(xì)胞處于細(xì)胞分裂期間，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA基因組才能接觸到宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒只能在分裂中的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。,,

4、,急性轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒 Acute Transforming Retrovirus,感染特點(diǎn)：潛伏期短 不能獨(dú)立感染，需要輔助病毒 具有體外惡性轉(zhuǎn)化相應(yīng)靶細(xì)胞能力結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)基因常常有不同類型缺損，是復(fù)制缺陷性非感染性病毒，它獲得了特定基因序列，即外加基因（癌基因）取代了基因組的一部分。通常只含一種癌基因。,非急性轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒 Non-acute transforming r

5、etrovirus,感染特點(diǎn)：需要經(jīng)過較長(zhǎng)的潛伏期才能致病。 獨(dú)立感染，無需輔助病毒。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：完整，無插入的外加基因。不包含癌基因，在體外不能惡性轉(zhuǎn)化相應(yīng)靶細(xì)胞。致癌相關(guān)基因：300--1200 bp LTR（含啟動(dòng)子增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)信號(hào)）。LTR可能啟動(dòng)插入位點(diǎn)下游的基因（如原癌基因活化）。,病毒癌基因來源,從宿主細(xì)胞DNA中俘獲的特定DNA序列：通過感染宿主細(xì)胞，俘獲宿主src DNA序列。如白血病病毒A

6、LV(無V-src) → ASV(含V-src) V-src雖然來自真核細(xì)胞，但沒有內(nèi)含子。,2．DNA腫瘤病毒,DNA腫瘤病毒的研究證據(jù)：首先來自流行病學(xué)研究。 某些病毒與人基因某些序列同源 與某些蛋白同源（尤其癌基因蛋白產(chǎn)物） 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)某些病毒引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能： 整合后引起細(xì)胞癌基因紊亂 表達(dá)癌基因樣蛋白 病毒蛋白與特定細(xì)胞癌基因蛋白之間存在互相作用,2．DNA腫瘤病毒,在自然

7、狀態(tài)下，DNA腫瘤病毒能夠廣泛地感染包括人類在內(nèi)的許多動(dòng)物，其中有一些注射動(dòng)物后能誘發(fā)腫瘤，并能在體外使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性表現(xiàn)型的細(xì)胞。目前，與動(dòng)物和人類惡性腫瘤相關(guān)的DNA腫瘤病毒分為5個(gè)主要的科，包括乳頭狀瘤病毒科（如人類乳狀瘤病毒）、多瘤病毒科（如猴病毒40―SV40、小鼠多瘤病毒、人類BKV和TCV等）、腺病毒科（如人類腺病毒）、皰疹病毒科（如人類單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型、人類EB病毒）和乙型肝炎樣病毒科（如人類乙型肝炎病毒）。,

8、(二) 細(xì)胞癌基因,細(xì)胞癌基因（Cellular Oncogene，c-onc）：在正常細(xì)胞中與病毒癌基因有同源的序列。是一類編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的正常細(xì)胞基因，在細(xì)胞生存、生長(zhǎng)、發(fā)育、分化中有重要功能。在正常細(xì)胞內(nèi)未激活的細(xì)胞癌基因叫原癌基因，當(dāng)其受到某些條件激活時(shí)，結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生異常，能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。,原癌基因,原癌基因(proto-onc)：細(xì)胞癌基因在正常細(xì)胞以非激活形式存在，稱為原癌基因。在正常細(xì)胞表達(dá)水平低，也不會(huì)

9、引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因的一般特性，即內(nèi)含子和外顯子。不同種生物其原癌基因內(nèi)含子有較大差異，而外顯子序列保守。,(三)病毒癌基因與細(xì)胞癌基因的差別,病毒癌基因通常丟失兩端的某些序列。病毒癌基因沒有內(nèi)含子，細(xì)胞癌基因通常含有內(nèi)含子和插入序列。 病毒癌基因常會(huì)出現(xiàn)堿基取代或堿基缺失等突變，而細(xì)胞癌基因則較少。,(四)原癌基因的分類,根據(jù)其蛋白產(chǎn)物的功能分類： src癌基因家族

10、 ras癌基因家族 sis癌基因家族 erb癌基因家族 myc及其它核內(nèi)癌基因家族,1、src癌基因家族,大都具有酪氨酸蛋白激酶（Tyrosine protein kinase）活性。src, fos, fps,fgr, yes, ros, abl等,2、ras癌基因家族,ras癌基因家族編碼21kD 的GTP結(jié)合蛋白，即P21。 H-ras來自大鼠肉瘤病毒Harvey株 K-ra

11、s來自大鼠肉瘤病毒Kirsten株 N-ras來自神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma),3、sis癌基因家族,sis癌基因編碼生長(zhǎng)因子樣活性物質(zhì)。 其表達(dá)產(chǎn)物第99--207氨基酸序列與血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）B鏈同源。,4、erb癌基因家族,erb癌基因家族 編碼細(xì)胞骨架蛋白類。包括erb-A, fms, mas, trk等基因。,5、myc及其它核內(nèi)癌基因家族,myc(c-myc, n-myc, 等等)癌基因家族

12、編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)，屬于DNA結(jié)合蛋白。C-fos族: Fos-Jun異二聚體，與DNA結(jié)合C-jun族: Jun-Jun同二聚體 Jun-fos異二聚體Myb族：myb, myb-ets復(fù)合物,二．抑癌基因 tumor suppressor gene,概念：存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一大類可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并有潛在抑制細(xì)胞癌變作用的基因。抑癌基因的確定依據(jù)在某特定惡性腫瘤的相

13、應(yīng)正常組織中有正常表達(dá)。在該惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)生變異或缺失，如點(diǎn)突變、DNA片段缺失等。將此基因?qū)朐搻盒阅[瘤細(xì)胞中能部分或完全抑制其惡性表型。,抑癌基因,Rb基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和鑒定的抑癌基因。 第二個(gè)被鑒定的抑癌基因p53的突變可見于高達(dá)50%以上的人癌中，它是人類惡生腫瘤中最常見的基因改變。APC DCC…,癌基因與抑癌基因的相互作用,自20世紀(jì)80年代后期，癌癥的研究開始注意癌基因與抑癌基因產(chǎn)物的相互作用，并提出每種生

14、長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因通過反饋機(jī)制調(diào)節(jié)其他基因的概念。 細(xì)胞的生長(zhǎng)是推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)行的基因產(chǎn)物與抑制其進(jìn)行的基因產(chǎn)物之間微妙平衡的結(jié)果。任何一種產(chǎn)物的異常表達(dá)，如一種癌基因的過度表達(dá)，或一種抑癌基因的失活，都可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的失控。,第二節(jié) 癌基因與抑癌基因在細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用,,一．癌基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,表達(dá)生長(zhǎng)因子樣活性物質(zhì)表達(dá)生長(zhǎng)因子受體低分子量G蛋白細(xì)胞漿內(nèi)蛋白激酶細(xì)胞漿調(diào)節(jié)蛋白核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,1、表達(dá)生長(zhǎng)

15、因子樣活性物質(zhì),sis基因：表達(dá)產(chǎn)物與血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）B鏈具有同源結(jié)構(gòu)。int-2,hst：表達(dá)產(chǎn)物與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）具有同源結(jié)構(gòu)。,2、表達(dá)生長(zhǎng)因子受體,具酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜生長(zhǎng)因子受體： C-erb-B：表皮生長(zhǎng)因子（EGF）受體，缺少胞外結(jié)構(gòu)域（掐頭） C-fms：集落刺激因子（CSF－1）受體 bit：PDGF受體 ros：胰島素受體可溶性酪氨酸激酶受體：met、 tr

16、k非蛋白激酶受體：erb-A： 甲狀腺素或類固醇激素受體；mas: 血管緊張素受體,3.表達(dá)細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路蛋白,低分子量G蛋白 H-ras、K-ras、N-ras等基因表達(dá)低分子量G蛋白 參與細(xì)胞增殖信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。胞內(nèi)蛋白激酶 與膜結(jié)合的蛋白酪氨酸激酶：abl、src家族 胞漿絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶：cot、mos、pin-1、raf胞漿調(diào)節(jié)蛋白 crk,4.核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,反式作用因子：能與

17、DNA特異結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子。特點(diǎn)：首先接受信息，被誘導(dǎo)合成，又進(jìn)一步調(diào)節(jié)其它基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。轉(zhuǎn)錄mRNA半衰期短，其蛋白產(chǎn)物半衰期也短 Fos-Jun(AP-1)→ TRE(T reaction element)CREB-Jun → CREC-myc(堿性氨基酸)→ 單雙鏈DNARel(NF-Κb相關(guān)蛋白),二．癌基因和抑癌基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用,細(xì)胞周期及其調(diào)控機(jī)制,1、細(xì)胞周期,細(xì)胞周期分兩個(gè)階段

18、： 有絲分裂期：前期、中期、后期、末期有絲分裂間期：G0、G1、S 、G2G0：G1期細(xì)胞進(jìn)入休止?fàn)顟B(tài)。暫時(shí)的或永久的—終末分化神經(jīng)細(xì)胞G1：RNA和蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞增大，為DNA合成作準(zhǔn)備，G1 checkpoint。S：DNA復(fù)制G2: 細(xì)胞繼續(xù)增大，合成新蛋白質(zhì)，G2 checkpoint.,2．細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,周期蛋白（cyclin）：有一類特殊蛋白質(zhì)合成與降解與細(xì)胞周期同步，稱為周期蛋白。有A-H 8種。能

19、組成周期蛋白依賴性激酶的調(diào)節(jié)亞單位，其二級(jí)結(jié)構(gòu)有相似于“周期蛋白框”的一致性共有序列的一類蛋白質(zhì)。周期蛋白框：含有約100氨基酸區(qū)域，包含α1-5共5個(gè)螺旋，是介導(dǎo)周期蛋白與其激酶催化亞基cdc2結(jié)合的關(guān)鍵部位。,周期蛋白依賴性激酶 cyclin-depende protein kinases, CDKs,概念：必需與周期蛋白結(jié)合才具有活性，能催化特異蛋白底物的Ser/Thr磷酸化 。,周期蛋白依賴性激酶抑制物 Cyclin-de

20、pendent inhibitor protein, CDKI,P21家族（P21、P27、Dacapo）：抑制所有CDKP16家族(P16、P15、P18、P19、PHO81)：抑制cyclin D－CDKP40、FAR1、Rum1,周期蛋白-CDK-CDKI系統(tǒng)與腫瘤的關(guān)系,Cyclin、CDK過度表達(dá)：細(xì)胞周期調(diào)控異常，減數(shù)分裂失控，導(dǎo)致腫瘤CDKI：抑制細(xì)胞增殖，在防止細(xì)胞轉(zhuǎn)化和惡變中起關(guān)鍵作用。CDKI多是抑癌基因產(chǎn)物

21、。 原發(fā)性腫瘤多有p16或/和p15基因缺失和突變。,抑癌基因p53基因,染色體定位：17p13.1基因結(jié)構(gòu)：長(zhǎng)約20 kb，11個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 kb。第1個(gè)外顯子不編碼，2，4，5，7，8編碼5 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。蛋白產(chǎn)物：長(zhǎng)度 393個(gè)氨基酸，分子量53 kD。,p53基因的功能,與DNA結(jié)合，在G1期檢查DNA損傷點(diǎn)，監(jiān)視基因組完整性 a.抑制cyclin A表達(dá) b.阻礙DNA聚合酶與D

22、NA復(fù)制起始復(fù)合物結(jié)合 c.其氨基末端區(qū)有轉(zhuǎn)錄激活作用，激活某些抑制細(xì)胞分裂的基因表達(dá),p53基因的功能,細(xì)胞未受損傷時(shí)，p53與mdm2結(jié)合，運(yùn)送到細(xì)胞漿，泛素化而降解。細(xì)胞受損傷時(shí)，p53被磷酸化，與mdm2解離，激活某些抑制細(xì)胞分裂的基因轉(zhuǎn)錄。,Rb基因（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因）,染色體定位：13q14基因結(jié)構(gòu)：≥200 kb，27個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4.7 kb蛋白產(chǎn)物：長(zhǎng)度 928個(gè)氨基酸分子量：105 k

23、D (P105-RB)部位：核內(nèi)功能：在G0，G1期與E2F結(jié)合，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性，抑制多種原癌基因表達(dá)，控制細(xì)胞周期信息系統(tǒng)。去磷酸化形式是其活性形式。,第三節(jié)、化學(xué)致癌的機(jī)制,尚未徹底闡明，大體可分為遺傳機(jī)制學(xué)說和非遺傳機(jī)制學(xué)說。,癌變的機(jī)制,,癌變機(jī)制 — 基因表達(dá)異常表現(xiàn),1. 遺傳（基因）機(jī)制,染色體－DNA,一級(jí)結(jié)構(gòu)改變,DNA序列突變、丟失、擴(kuò)增、易位（不可逆性）,腫瘤,遺傳學(xué)研究?jī)?nèi)容,,,,,癌變機(jī)制 — 基

24、因表達(dá)異常表現(xiàn),2. 表遺傳（非編碼）機(jī)制,+,一、化學(xué)致癌的遺傳機(jī)制學(xué)說,該學(xué)說認(rèn)為，化學(xué)致癌物進(jìn)入細(xì)胞后作用于遺傳物質(zhì)，通過引起細(xì)胞基因的改變而發(fā)揮致癌作用。有關(guān)學(xué)說最主要的是多階段學(xué)說和癌基因?qū)W說。,目前認(rèn)為：化學(xué)致癌是長(zhǎng)期的、復(fù)雜的多階段過程，至少涉及引發(fā)、促長(zhǎng)和進(jìn)展三個(gè)階段。在引發(fā)階段主要是細(xì)胞原癌基因和抑癌基因的突變?cè)诖匍L(zhǎng)階段主要是遺傳外機(jī)制在進(jìn)展階段主要是增加核型不穩(wěn)定性。正常細(xì)胞經(jīng)過遺傳學(xué)改變的積累才能轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

25、癌細(xì)胞。,2、化學(xué)致癌的癌基因?qū)W說 調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的基因發(fā)生異常，可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖，不能及時(shí)分化和凋亡，形成腫瘤。與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因主要有癌基因和抑癌基因。,二、化學(xué)致癌的非遺傳機(jī)制學(xué)說,一部分致癌物用目前的致突變?cè)囼?yàn)不能檢出其致突變性。這些非遺傳毒性致癌物促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的機(jī)制多種多樣。目前最熱點(diǎn)的非遺傳機(jī)制學(xué)說是化學(xué)致癌的表觀遺傳機(jī)制學(xué)說。,表遺傳是近年來在腫瘤基礎(chǔ)研究中發(fā)展迅速并具有光輝前景的學(xué)科，過去一般認(rèn)為抑

26、癌基因失活是通過點(diǎn)突變或丟失來完成，而現(xiàn)在的研究表明許多抑癌基因表達(dá)關(guān)閉是導(dǎo)致抑癌基因失活的重要原因。這一過程又是通過DNA甲基化及染色質(zhì)構(gòu)型的改變來控制的。,表遺傳（非編碼遺傳，epigenetic ）：,令人感興趣的是：經(jīng)典遺傳學(xué)中DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變是不可逆的，而表遺傳中的改變，包括DNA甲基化及組蛋白去乙?；际强赡娴摹＿@一點(diǎn)證明了腫瘤細(xì)胞的可操作性。為腫瘤的預(yù)防和防治提供了理論基礎(chǔ)。,表遺傳（非編碼遺傳，epigenetic

27、）：,（一）、表遺傳學(xué)的基因調(diào)控機(jī)制,表遺傳學(xué)調(diào)控涉及的機(jī)制,主要包括,,×2拷貝,組蛋白修飾,組蛋白,核小體(nuclesomes ),分離體,異八聚體的核心 + 約150個(gè)DNA堿基對(duì)圍繞其外周,,,,,,緊密和有組織的染色質(zhì),高度有規(guī)則的結(jié)構(gòu),捆扎,,核小體之間由組蛋白H1結(jié)合相聯(lián),核小體結(jié)構(gòu),,核心組蛋白的---N---端尾部暴露在核小體的表面并可被共價(jià)修飾,對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用,,,基因調(diào)控作用,改變,① 

28、; 影響組蛋白與DNA雙鏈的親和性,,組蛋白修飾對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控主要是通過：,染色質(zhì)的疏松或凝染狀態(tài)（染色質(zhì)重塑）,② 影響其他轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的親和性,發(fā)揮,常見的組蛋白尾部修飾方式,,① 染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化對(duì)基因表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用。② 組蛋白介導(dǎo)多種信息通路。,“組蛋白密碼”假說，由Strch1和Allis于2000年提出：,總之：組蛋白密碼的識(shí)別過程是個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)狀系統(tǒng)，不但各種修飾之間相互聯(lián)

29、系，相互影響，各種修飾和DNA修飾之間也相互影響。,染色質(zhì)重塑,,,,染色質(zhì)緊密的超螺旋結(jié)構(gòu)限制了轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DNA的接近與結(jié)合，從而抑制了真核細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄過程。,需染色質(zhì)發(fā)生一系列重要的變化,使轉(zhuǎn)錄因子更易接近,并結(jié)合核小體DNA,該結(jié)構(gòu)變化稱染色質(zhì)重塑（ chromatin remodeling ）,基因,,染色質(zhì)共價(jià)化學(xué)修飾：發(fā)生在組蛋白末端“尾巴”的乙?；?、磷酸化、甲基化。,染色質(zhì)重塑,,,依賴ATP的染色質(zhì)重塑復(fù)合體主要有三類

30、：,復(fù)合體是一種以ATP酶為催化中心的多種蛋白亞基復(fù)合體,,共同作用在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中相輔相成，共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。,有明顯區(qū)別,又密切聯(lián)系在一起,在染色質(zhì)重塑過程中，不同復(fù)合體在功能,,DNA甲基化可通過甲基化結(jié)合蛋白招募組蛋白修飾酶,+,參與染色質(zhì)重塑,染色質(zhì)重塑酶,因此，染色質(zhì)重塑是在多種包括DNA甲基化結(jié)合蛋白招募組蛋白修飾酶和染色質(zhì)重塑酶等相互聯(lián)系而又不同的分子事件下完成的。,,3、 DNA甲基化 在DNA甲基化過程中，胞

31、嘧啶從DNA雙螺旋突出進(jìn)入與酶結(jié)合部位的裂隙，通過DNMT催化把活性甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的5-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, m5C）,胞嘧啶,5-甲基胞嘧啶,哺乳動(dòng)物細(xì)胞整體的DNA甲基化形式至少有3種DNMT相互作用后形成。人類中最常見的DNMT可分為兩類包括從頭合成甲基化（從頭甲基化de novo methylation）的DNMT3a、DNMT3b與維持DNA甲基化的DNMT1。,

32、從頭甲基化是在有甲基化的DNA雙鏈上進(jìn)行甲基化。主要發(fā)生在受精后去甲基化至植入后需要重新甲基化的胚胎細(xì)胞中。,,而維持DNA甲基化主要與復(fù)制后形成的半甲基化DNA發(fā)生反應(yīng)，根據(jù)親本鏈的甲基位點(diǎn)在復(fù)制鏈對(duì)稱回文結(jié)構(gòu)相應(yīng)的胞嘧啶上進(jìn)行甲基化。 這樣就獲得了與親本DNA完全相同的甲基化形式。,最近發(fā)現(xiàn)人類DNMT3a和DNMT3b基因的表達(dá)在幾種腫瘤細(xì)胞株中升高，提示這些基因編碼的蛋白質(zhì)可能參與腫瘤形成過程中抑癌基因的從頭甲基化。,Cp

33、G甲基化,人類基因的三分之一由散在的重復(fù)DNA片段組成，這些DNA片段中又有許多CpG二核苷酸聚集，這稱為CpG島，它們具有潛在的轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)DNA甲基化異常是在CpG島位與基因5’端時(shí)，則與基因的活性有關(guān)（如許多抑癌基因5’端均存在CpG島并受甲基化調(diào)控）。DNA甲基化的改變通過對(duì)染色體構(gòu)形及其結(jié)構(gòu)的影響來影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。,CpG島,DNA甲基化只發(fā)生在位于CpG二核苷酸中鳥苷5’側(cè)的胞嘧啶堿基處。這種CpG二核苷酸在基因組中分

34、布不均：,基因組的大部分相當(dāng)缺少CpG，這種現(xiàn)象稱為CpG抑制。,約1%的基因組是由CpG豐富的區(qū)組成的----CpG島。,CpG島特征：,①  CpG島為0.5kb~4kb長(zhǎng)度的短區(qū)，并與管家基因有關(guān)。,②  CpG島位于基因組中約50%~60%基因的近側(cè)啟動(dòng)子區(qū)。也有位于基因的5’編碼區(qū)或位于下游的內(nèi)含子中。,CpG島特征：,③ CpG島總是未甲基化的，但在癌細(xì)胞中這些啟動(dòng)子區(qū)常甲基化過度并已成為在腫瘤

35、中發(fā)生的最明確的基因外變化，同時(shí)在每種類型的腫瘤中均被發(fā)現(xiàn)。并與抑癌基因的沉默有關(guān)。,④ CpG島的從頭甲基化是在腫瘤形成過程中的關(guān)鍵事件。它們甚至可能比經(jīng)典的抑癌基因在人癌中因突變而失活更常見。,總之，DNA甲基化參與胚胎發(fā)育、衰老、腫瘤發(fā)生等諸多生理和病理過程，是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式之一。,CpG甲基化突變熱點(diǎn)與腫瘤,1）  CpG甲基化突變,CpG位點(diǎn)是人類胚胎期基因突變的熱點(diǎn)部位。CpG位點(diǎn)也是腫瘤中癌基

36、因和抑癌基因突變的熱點(diǎn)部位。正常情況下，隨著物種的進(jìn)化，基因組中的C不斷發(fā)生脫氨基轉(zhuǎn)換成尿嘧啶（U），再被U糖苷酶切除修復(fù)成T。基因組中5’－甲基胞嘧啶（5－Me－C，M）更易脫氨基直接轉(zhuǎn)換成T, 使C→T（錯(cuò)配為G→A）的轉(zhuǎn)換延續(xù)發(fā)生。,結(jié)果：使G+C含量下降，實(shí)際上可以理解為C比率減少或C—T轉(zhuǎn)換增加。在基因組廣大區(qū)域CpG位點(diǎn)密度大幅度下降的現(xiàn)象稱為CpG抑制。 非甲基化C也可以脫氨基轉(zhuǎn)換為U，但DNA需要經(jīng)過兩次復(fù)制

37、周期后，C才能突變?yōu)門。,C變?yōu)門的速率低于5mC突變?yōu)門的速率。具體原因?yàn)椋?① 5mC能自發(fā)脫氨基形成胸腺嘧啶速率高于非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ乃俾剩瑸?0~40倍。,② 5mC和C自發(fā)脫氨基分別形成T→G 錯(cuò)配和U→G 錯(cuò)配。,又因?yàn)閁不是DNA的正常成分，U—G 錯(cuò)配易被U—DNA糖基化酶識(shí)別而被切除，再經(jīng)β－DNA聚合酶修復(fù)使U—G錯(cuò)配恢復(fù)為C—G配對(duì)。 而T→G 錯(cuò)配不易被T－DNA糖基化酶切除因而發(fā)生C→T突

38、變。,③ DNA復(fù)制后產(chǎn)生少量T－G→T－A的錯(cuò)誤修復(fù)，使原來的C—G復(fù)制成T—A 。,④ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）具有酶促5mC或C轉(zhuǎn)變?yōu)門的作用，也增加了C→T突變。,突變可能涉及到甲基胞嘧啶脫氨基以外的機(jī)制，在腫瘤中，CpG位點(diǎn)突變主要是C—T 顛換。,總之，CpG突變的方式是多種：,甲基化修飾的相關(guān)序列因外源性致癌劑的不同而發(fā)生不同的突變，而且外源性致癌劑與DNA形成的加合物的不同異構(gòu)體亦產(chǎn)生不同的突變。,CpG位點(diǎn)胞嘧

39、啶甲基化大大增加了鳥嘌呤被大量化學(xué)物質(zhì)致烷基化作用。,化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的CpG位點(diǎn)的損傷要比其他部位的損傷修復(fù)慢。,因此，甲基化了的CpG位點(diǎn)的各種損 傷因素可能是人類腫瘤中突變產(chǎn)生的主要 誘因，這并不排除在CpG位點(diǎn)形成的加合 物較其他序列處形成的加合物具有較高的 致突變的可能。,所以認(rèn)為CpG位點(diǎn)是個(gè)突變的 熱點(diǎn)部位，且CpG位點(diǎn)的甲基化增高 促進(jìn)了突變的發(fā)生。當(dāng)這些突變積累 到一定的程度，即發(fā)生細(xì)胞的突

40、變。,在多種類型腫瘤中，常有比正常組織較低的基因組m5C含量，如結(jié)腸癌的m5C水平低于腺瘤性息肉，而兩者均低于正常結(jié)腸組織。 因此，在癌中，這種高頻率的基因組甲基化低下，提示它可能授予腫瘤生成中的選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。,DNA甲基化過度也可以是甲基化低下的結(jié)果，甲基化低下可以引起代償性從頭甲基化反應(yīng)。,由CpG島甲基化過度而滅活的抑癌基因有若干重要特征：,① 在啟動(dòng)子區(qū)正常存在的未甲基化的CpG島發(fā)生密集的甲基化。,② 在腫瘤中缺少

41、編碼區(qū)的突變。,③ 在腫瘤中缺少基因特異的轉(zhuǎn)錄物。,④ 用DNMT抑制劑（5－偶氮胞嘧啶）可重新激活沉默的基因。,⑤ 由甲基化過度而喪失的基因功能可與基因突變性失活的相比較。,2）  DNA甲基化與腫瘤,① 各種突變引起甲基化位點(diǎn)丟失。,⑴ 腫瘤細(xì)胞DNA普遍低甲基化,其原因:,② DNA烷基群粘合引起甲基化位點(diǎn)空間排列阻斷。,③ 化學(xué)致癌劑與DNA形成加合物妨礙了甲基化轉(zhuǎn)移酶靠近和識(shí)別甲基化位點(diǎn)使DNA接受甲基的能

42、力大大下降。,④ 化學(xué)致癌劑與酶分子結(jié)合從而抑制了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。,⑤ 致癌劑在體外代謝時(shí)形成甲基化酶底物S－腺苷甲硫氨酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制可干擾甲基化反應(yīng)。,⑥ 甲基供體分子的丟失。,腫瘤該種現(xiàn)象被認(rèn)為DNA低甲基化在腫瘤細(xì)胞中廣泛存在。,⑵ 腫瘤細(xì)胞DNA區(qū)域性高甲基化,其形成原因尚不清楚，研究顯示：,① 腫瘤細(xì)胞株的酶活性是正常細(xì)胞株的4～ 3000倍，此后又發(fā)現(xiàn)在結(jié)構(gòu)癌等多種腫瘤 甲基轉(zhuǎn)移酶活性不僅增加，且mR

43、NA表達(dá)也 較正常組織明顯增高。,② 只有腫瘤細(xì)胞株才具有重新甲基化酶活性,認(rèn)為抑癌基因的高甲基化主要是由于甲 基化酶活性增高的結(jié)果。應(yīng)用DNA甲基化酶 抑制劑5-脫氧雜氮胞苷可降低眾多受抑基因 如Rb、VHL、WT3、P16、P15等的甲基化，并使基因重新表達(dá)。腫瘤的惡性表型也不同 程度的發(fā)生逆轉(zhuǎn)。,③ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶還可以促進(jìn)甲基化的胞嘧啶脫氨基作用，引起C→T的轉(zhuǎn)換突變。特別在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的DNA中作用

44、更突出。,因此，高的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及其活性通過DNA高甲基化和致突變二種機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生。,異常的啟動(dòng)子甲基化與基因功能的喪失有關(guān)，它們像基因突變一樣也能給腫瘤細(xì)胞提供選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。,基因外基因沉默能在腫瘤進(jìn)展過程中誘發(fā)突變，如：MGMT（O6－甲基鳥嘌呤－DNA－甲基轉(zhuǎn)移酶）是一種與結(jié)腸癌，肺癌及淋巴瘤中啟動(dòng)子甲基化有關(guān)沉默的DNA修復(fù)基因，其蛋白產(chǎn)物能從DNA中除去由致癌劑誘發(fā)的O6—甲基鳥嘌呤加合物。它如果留著未能被修復(fù)的話

45、，會(huì)導(dǎo)致G→A 轉(zhuǎn)變。有沉默MGMT等位基因的腫瘤會(huì)誘發(fā)關(guān)鍵基因的突變TP53及K－RAS，這種啟動(dòng)子甲基化過度可以在尚未含有基因突變的癌前息肉病變中出現(xiàn)，先于基因變化而發(fā)生。,而且這類基因外變化能在病人的表面上似乎正常的組織和癌前病變中出現(xiàn)。如MCH1（DNA錯(cuò)配修復(fù)基因的一種）常在伴有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MS1）的散發(fā)型結(jié)腸癌和子宮內(nèi)膜癌中甲基化過度，而這種在MCH1的5’區(qū)甲基化變化的增加可在病人表面上似乎正常的結(jié)腸上皮和子宮內(nèi)膜的癌

46、前增殖病變中觀察到。,因此，基因中的基因外表型遺傳改變?cè)谟行┌┌Y中是早期的致癌變化。,檢測(cè)這些變化有助于通過飲食改變或干預(yù)來防癌。,用甲基化檢測(cè)用來預(yù)測(cè)一個(gè)體的癌癥易感性并對(duì)其采取預(yù)防措施。,（二）、表遺傳參與化學(xué)致癌作用的主要機(jī)制,研究表明：某些化學(xué)致癌物的致癌作用是通過DNA甲基化。如：苯己妥鈉可引起敏感BLC3F/肝內(nèi)細(xì)胞甲基化水平↓— (可逆)不引起不敏感C57BL6細(xì)胞甲基化的改變,非遺傳化學(xué)致癌物,GC區(qū)甲基化明顯改變,,

47、mRNA蛋白表達(dá)↑,,,表明：某些致癌性化學(xué)DNA甲基化的改變?cè)诓煌笙抵凶兓潭鹊牟町惙从沉怂鼈儗?duì)致癌物的敏感性不同。,因此，并不是所有的非遺傳毒性致癌物都是通過干擾DNA甲基化而產(chǎn)生其作用。,準(zhǔn)確些說：很可能直接干擾表遺傳狀態(tài)，可能是某些非遺傳毒性致癌物作用機(jī)制的主要特征。,金屬,如：,鎘,大鼠肝細(xì)胞株DNA高甲基化,大鼠肝細(xì)胞株DNA低甲基化,砷,DNA甲基化的改變,鎳,基因表達(dá)的改變,基因沉默,,,,基因沉默的原因：,DNA甲基

48、化↑,均與基因沉默有關(guān),異染色質(zhì),,,,① DNA模型重建（remodelling）酶 此酶利用ATP水解產(chǎn)生的能量重建染色質(zhì)結(jié)構(gòu)② 組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（HATs）③ 組蛋白脫乙?；?此酶對(duì)組蛋白的蛋白成分中賴氨酸殘基進(jìn)行乙酰化或去乙?；＂?組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMTs） 此酶使組蛋白的賴氨酸和賴氨酸的殘基甲基化。,化學(xué)致癌物干擾DNA甲基化與表遺傳,1）直接抑制酶的活性而干擾DNA甲基化,鎳暴露細(xì)胞系中

49、基因組蛋白H3和H4乙?；瘻p少，鎳在體外抑制GCn55PHAT酶的活性，以及引起在體內(nèi)組蛋白H4中特定的賴氨酸殘基乙?；拿黠@降低。,在建立和維持DNA甲基化模式以及表遺傳狀態(tài)中,起至關(guān)重要的作用。,如：,因此，很可能致癌性化學(xué)物和金屬是通過直接抑制表遺傳信息與傳遞所需這些酶的活性而干擾DNA甲基化。,,,可因同時(shí)注射甲硫氨酸而得到預(yù)防。 提示：這些化合物可能大量消耗細(xì)胞的SAM而導(dǎo)致低甲基化。,2）影響代謝途徑干擾DNA甲基化

50、,體內(nèi)甲基的主要供體S－腺苷甲硫氨酸（SAM）的合成,由肝致癌物,表達(dá) ↑,,,3）甲基化供體對(duì)DNA甲基化的影響,研究證明，飲食與營養(yǎng)狀況對(duì)肝及其它臟器的表遺傳程序（programming）有明顯的影響：,,① 當(dāng)飲食中含有的甲基供體分子,不會(huì)引起整個(gè)基因組DNA低甲基化,,,③ 表遺傳改變與細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān),4）致癌物通過激活核受體途徑而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生表遺傳致癌作用。,所研究結(jié)果表明：膳食中參與合成SAM的氨基酸不足,D

51、NA的甲基化水平,產(chǎn)生有害作用,,表遺傳機(jī)制也為某些種類發(fā)育毒物作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。DNA甲基化改變?cè)诓溉轭惻咛グl(fā)育過程中起重要作用。若在哺乳類發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期暴露于外來化合物會(huì),雌激素類非遺傳毒物致癌,引起DNA甲基化持久的可遺傳的改變—基因調(diào)控的改變,導(dǎo)致有害的生物學(xué)作用,,如：,,雌激素應(yīng)答基因啟動(dòng)子的DNA甲基化,二乙基己烯雌酚（DES）作用于嚙齒類動(dòng)物（圍產(chǎn)期）,基因表達(dá)的持久性改變,暴露細(xì)胞的類型改變,,雌激素受體控制下的某些

52、基因,該種變化的基因表達(dá)模式可通過發(fā)育維持到成年。,新生鼠 + DES（含苯黃酮）,(乳鐵傳遞蛋白、EGF、c-fos、c-jun、c-myc〕持久性基因改變（上調(diào)或下調(diào)）DNA甲基化,,關(guān)鍵問題：何種表遺傳改變（以及相關(guān)的基因表達(dá)的改變）使暴露于DES的新生小鼠在以后的生命期中產(chǎn)生癌。,新生鼠雄性,雌激素類化合物,若出生前,+,DES,發(fā)現(xiàn)在核糖體DNA序列中有大量的DNA甲基化,+,生殖組織永久性基因改變，但未發(fā)現(xiàn)DNA甲基化,