四節(jié)基因的表達調(diào)控與癌基因

1、第四節(jié) 基因的表達調(diào)控與癌基因,基因表達=基因轉(zhuǎn)錄+翻譯基因表達的調(diào)控: 生物體隨時調(diào)整不同基因的表達狀態(tài),以適應環(huán)境、維持生長和發(fā)育需要,基因的表達調(diào)控包括,基因水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工的調(diào)控mRNA從細胞核向胞質(zhì)轉(zhuǎn)運過程的調(diào)控翻譯水平的調(diào)控以及翻譯后的加工等,基因表達的調(diào)控方式 阻遏負調(diào)控:調(diào)控蛋白+DNA序列 基因的表達

2、 (相應蛋白質(zhì)降低) 促進正調(diào)控:調(diào)控蛋白+DNA序列 基因的表達 (相應蛋白質(zhì)增加),,,一 原核生物基因表達的調(diào)控,方式特點調(diào)控機制 --操縱子,正調(diào)控負調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯偶聯(lián)快速乳糖操縱子 --負、正調(diào)控 轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控

3、 色氨酸操縱子--負調(diào)控　 轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控,,,一個操縱子 =編碼序列（2-6） +啟動序列+操縱序列+(其他調(diào)節(jié)序列) 操縱子：原核生物中幾個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇串聯(lián)排列組成的一個基因表達的協(xié)同單位,,調(diào)控區(qū) 結(jié)合RNA聚合酶和調(diào)節(jié)蛋白,,,編碼功能相關(guān)的蛋白質(zhì),介導轉(zhuǎn)錄終止,轉(zhuǎn)錄出多順反子mRNA，翻譯后得到多種蛋白質(zhì),,操縱子的基本結(jié)構(gòu),三個結(jié)構(gòu)基因,Z,Y

4、,A,,,,,β半乳糖苷酶,乳糖通透酶,乙?；?乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制 （一）乳糖操縱子的結(jié)構(gòu),5’,P I P,操縱序列O,,終止子,3’,CAP結(jié)合位點,Z,Y,A,阻遏蛋白,,,I,×,別乳糖（或IPTG）,,,乳糖,,,,,mRNA,轉(zhuǎn)變,阻遏蛋白,,×,,I,,,（二）阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié),1.阻遏,2.去阻遏,,CAP結(jié)合位點,,mRNA,5‘,3‘,2. 高葡萄糖濃度,5’,啟動子

5、P,操縱序列O,,終止子,3’,CAP結(jié)合位點,Z,Y,A,,×,cAMP,×,1. 低葡萄糖濃度,（三）CAP-cAMP的正性調(diào)節(jié),二 真核生物基因表達的調(diào)控,（一） 轉(zhuǎn)錄前基因水平的調(diào)控（二） 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控（三） 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控（四） 翻譯水平的調(diào)控（五） 翻譯后蛋白質(zhì)的加工,,（一） 轉(zhuǎn)錄前基因水平的調(diào)控,1 對核酸酶敏感，活化基因區(qū)易被DNase I降解 2 DNA拓撲結(jié)構(gòu)發(fā)生變化 3 DN

6、A堿基修飾呈低甲基化狀態(tài) 4 組蛋白的變化,（二）轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,a. 啟動子：RNA聚合酶和基本轉(zhuǎn)錄因子識別和結(jié)合的部位， 它們在啟動子上組裝成轉(zhuǎn)錄起始復合物b. 增強子：長度為100-200bp的含有特異的重復的DNA短片 段，是一些特異的轉(zhuǎn)錄活化因子結(jié)合部位，可 增強相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。c. 沉默子：為負性調(diào)控元件。特異的蛋白質(zhì)因子與沉默子

7、 結(jié)合后可抑制基因轉(zhuǎn)錄起始。,順式作用元件: DNA上的一段特定序列，可以和 轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合。,2. 反式作用因子： 與順式作用元件特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性,轉(zhuǎn)錄因子,啟動子,結(jié)構(gòu)基因,增強子,沉默子,,,,mRNA,三. 癌基因與抑癌基因,（一）癌基因的發(fā)現(xiàn)與分類癌基因：是一

8、類普遍存在于正常細胞內(nèi)調(diào)控細胞增殖和分化的重要基因 當它受到物理、化學或病毒等因素的作用，被“活化”而失去正常功能時才會導致正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化原癌基因：在正常細胞中以非激活形式存在的 癌基因,,,,（二）原癌基因的激活,1. 基因突變：各種理化因素造成的DNA損傷與突變2. 基因重排：基因易位3. 基因擴增：4. 基因插入：,（三）抑癌基因,1. 視網(wǎng)膜母細胞瘤（Rb）基因,Rb基因

9、,,P105Rb蛋白,,去磷酸化形式,磷酸化形式,,,促進細胞分裂,抑制細胞分裂,2. P53基因,,,抑癌基因,染色體定位,RB1,13q1,相關(guān)腫瘤,視網(wǎng)膜母細胞瘤，肺癌等,p53,17p,肺癌，肝癌等,BRCA1,17q21,乳腺癌,p16,9q21,黑色素瘤,部分抑癌基因,,,第五節(jié) 基因重組、基因診斷與基因治療,一、重組DNA（基因工程）,在體外按照一定的目的和方案對DNA分子進行人工操作，將同一來源或異源的基因進行重組，

10、然后把他們引入適當?shù)氖荏w細胞中，隨著細胞的繁殖，DNA重組體得到擴增，并同時得到表達,（一）重組DNA常用的工具酶,1. 限制性內(nèi)切酶,,,,限制性內(nèi)切酶,專一性,來 源,BamH I,Hind III,EcoR I,5’???GGATTC ???3’,5’???GAATTC ???3’,5’???AAGCTT ???3’,3’???CCTAGG ???5’,5’???CTTAAG ???3’,5’???TTCGAA ???3’,液化

11、芽孢桿菌,大腸桿菌Ry13,流感嗜血桿菌Rd,,,,,,,分子克?。簩我换蛞脒m當?shù)氖荏w細胞 基因組DNA中，使其進行復制， 從而重組DNA的大量拷貝。,,,基因,基因組DNA,,,,,復制,重組DNA,（二）重組DNA中常用的載體,1. 質(zhì)粒：細菌染色體外能自主復制的小分子 DNA，多為環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu),克隆載體：能攜帶外源基因進入受體細胞，

12、 并能在受體細胞內(nèi)復制和表達的DNA分子,,自主復制,2. 噬菌體DNA：可在細菌內(nèi)復制,3. 病毒：可在宿主細胞內(nèi)復制,4. 酵母人工染色體載體：為酵母基因和質(zhì)粒pBR322人工拼接的載體，可在大腸桿菌中復制.,2. DNA連接酶:,3. 逆轉(zhuǎn)錄酶:,4. 其它酶類:,mRNA,cDNA,,逆轉(zhuǎn)錄酶,,（三）基因工程的基本過程,目的基因的制備,載體DNA的選擇與制備,目的基因與載體DNA的體外重組,重組DN

13、A分子導入受體細胞,篩選及鑒定含重組分子的受體細胞,擴增重組分子以表達目的基因,,,目的基因擴增與表達,,,目的基因,質(zhì)粒載體,,,,,positive,GAPDH陽性對照,500bp,,1 2 M,電泳圖： 1：SHEE細胞 2：SHEEC細胞 3：DNA ladder,,,pGEM-T easy載體圖,重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖1,3,5,7：重組質(zhì)粒；2,4,6,8：EcoR I酶切后的重組質(zhì)粒；

14、M1：λDNA/EcoR I + Hind III markers ；M2：DNA ladder,2027bp,5148bp,500bp,M1 1 2 3 4 5 6 7 8 M2,,,,（四）基因工程的意義,1. 制藥,2. 農(nóng)業(yè)基因工程,3. 植物基因工程,4. 基因治療,5. 其它,二、基因診斷,基因診斷： 用分子生物學的技術(shù)對遺傳病腫瘤以及傳染性疾病等在基因水平上進行病原學以及細胞

15、遺傳基因的檢測和分析,（一）限制性片段長度分析,依據(jù)：限制性內(nèi)切酶能識別DNA上特定堿基序列。當基因發(fā)生突變時，可能會改變內(nèi) 切酶的識別位點。因而，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶水解DNA時，所得到的片段長度會發(fā)生改變 應用：遺傳病、腫瘤等疾病的診斷,應用：遺傳病、腫瘤等疾病的診斷,,,,,正常,病變,SNP診斷疾病示意圖,（二）分子雜交技術(shù),依據(jù)：核酸的變性和復性,應用：遺傳病、腫瘤和傳染性疾病的診斷,,,,探針,探針

16、,DNA,,應用：遺傳病、腫瘤和傳染性疾病的診斷,,,正常,病變,分子雜交診斷疾病示意圖,（三）聚合酶鏈式反應,依據(jù)：可對特定基因進行體外擴增。,應用：遺傳病的診斷、腫瘤和傳染性疾病 的檢測等。,原理：,（三）聚合酶鏈式反應,依據(jù)：可對特定基因進行體外擴增,應用：遺傳病的診斷、腫瘤和傳染性疾病 的檢測等,原理：,變性,退火,延伸,正常,病變,PCR診斷疾病示意圖,,,三個階段：,變性,退火 （復性）,延伸,