蛋白質(zhì)定性定量分析

1、2024/2/27,1,蛋白質(zhì)的定性定量分析,第二章,2024/2/27,2,蛋白質(zhì)的含量測定,凱氏定氮法：1883年丹麥化學(xué)家Kjeldhl建立，經(jīng)后人改良后形成的一種定量測定蛋白質(zhì)最為精確、敏感的方法。,原理：蛋白質(zhì)的含氮量為16％，只要測出樣品中氮的含量，即可計算出蛋白質(zhì)的含量,樣品中蛋白質(zhì)的含量＝N×6.25,2024/2/27,3,凱氏定氮的基本流程：,1、消化：生物樣品與濃硫酸共煮，樣品蛋白質(zhì)被無機化，其中氮元素轉(zhuǎn)

2、變?yōu)榱蛩徜@。,NH4OH+HCl NH4Cl+H2O,,2024/2/27,4,2024/2/27,5,,,2024/2/27,6,2024/2/27,7,凱氏法的評價：,優(yōu)點：,缺點：,1、適用于一切形態(tài)的樣品；,2、不用比色，對混濁不透明的樣品也可進(jìn)行分析；,3、結(jié)果的精、準(zhǔn)度較高。,1、樣品中含有非蛋白態(tài)氮時影響分析結(jié)果；,2、組成蛋白質(zhì)的氨基酸可影響分析結(jié)果；,3、操作復(fù)雜，對操作者的要求高。,2024

3、/2/27,8,Lowry法,Lowry法原理：是在雙縮脲法和Folin酚法的基礎(chǔ)上建立的一種新的蛋白質(zhì)定量方法。蛋白質(zhì)在堿性條件下與銅離子反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物。然后再與Folin試劑反應(yīng)生物深藍(lán)色。顏色與蛋白質(zhì)含量成正比，符合朗伯－比爾定律。,2024/2/27,9,方法評價,優(yōu)點,1、可對多個樣品同時進(jìn)行分析，操作簡便；,2、結(jié)合Folin酚法，提高了分析的靈敏度；,3、結(jié)合雙縮脲法，避免了Folin酚法的局限。,缺點,1、比色測定

4、，要求顯色后溶液透明，且樣品必需可溶；,2、酚方式劑在堿性溶液中穩(wěn)定性差，顯色后需盡快比色；,3、干擾反應(yīng)的因素較多。,2024/2/27,10,,,,,,,,,0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/ml,,,,,A0.80.60.40.2,2024/2/27,11,2024

5、/2/27,12,紫外吸收法,原理：蛋白質(zhì)在紫外區(qū)有兩個吸收峰，其一為280nm，由芳香氨基酸上共軛雙鍵引起，芳香氨基酸在各種蛋白質(zhì)的的含量差別不大，測蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸收值可計算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)第二紫外吸收峰在240nm以下，215nm最大，此峰是肽鍵引起?？赏ㄟ^215nm與225nm的差值計算出蛋白質(zhì)的含量。,2024/2/27,13,考馬斯亮藍(lán)G-250染色法,原理：考馬斯亮藍(lán)在一定濃度的乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)

6、紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收峰從465nm移到596nm。,優(yōu)點： （1）操作簡便；（2）敏感度較高（3）顏色穩(wěn)定（4）對干擾劑不敏感。,缺點： （1）染料與蛋白質(zhì)的實際狀況復(fù)雜，色素與樣品中的蛋白質(zhì)不一定以當(dāng)量相結(jié)合；（2）要求樣品完全溶解；（3）樣品不能回收使用。,2024/2/27,14,蛋白質(zhì)相對分子量的測定,SDS－PAGE法測蛋白質(zhì)的相對分子量：帶電顆粒在電場中的遷移主要受三個因素的作用，即場強、顆粒本身的電荷及分

7、子形狀。因此一般電泳無法直接測定蛋白質(zhì)的分子量。加入變性劑SDS后，蛋白質(zhì)變性肽鏈伸展且蛋白質(zhì)所帶電荷被SDS的負(fù)電荷覆蓋，在相同的電場下，蛋白質(zhì)的遷移率只與蛋白質(zhì)的分子量相關(guān)。,2024/2/27,15,lgMr=lgK-bm=K1-bm,2024/2/27,16,SDS-PAGE法測定分子量的操作：,1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的制備：按商品說明書使用。,2、待測樣品的制備：取待測蛋白質(zhì)樣品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7

8、.0)1ml溶解。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)一起加入等體積的樣品緩沖液，混勻，沸水浴加熱3分鐘后上樣。,3、電泳分離及染色：,2024/2/27,17,4、計算相對遷移率：,,,,,,,,,,,,,,,,,,2024/2/27,18,2024/2/27,19,2024/2/27,20,凝膠過濾測蛋白質(zhì)分子量：測定大分子的分子量是凝膠過濾的應(yīng)用之一。將已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行過濾層析，由于加入凝膠柱的物質(zhì)分子質(zhì)量不同，洗脫體

9、積也不同?？筛鶕?jù)洗脫體積求出柱的分配常數(shù)Kav，而Kav與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量之間又存在線性關(guān)系，利用這一關(guān)系可繪制出Kav與分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。,2024/2/27,21,2024/2/27,22,Ve＝K1－K2logMr,2024/2/27,23,2024/2/27,24,2024/2/27,25,方法的局限性：,1、在pH6～8的范圍內(nèi)，直線關(guān)系比較好，在極端pH時因蛋白質(zhì)變性而引起偏離；,2、分子量與分配系數(shù)Kav有關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的軸

10、比較大時，會引起測定偏離；,3、糖蛋白的含糖量大于5％時，測得的分子量比真實分子量大。,2024/2/27,26,2024/2/27,27,沉降速度法,2024/2/27,28,沉降平衡法,2024/2/27,29,等電聚焦測定蛋白質(zhì)的等電點,等電點分析：電泳結(jié)束后三氯乙酸固定并除去凝膠中的載體兩性電解質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)R－250染色，漂洗顯帶后測定蛋白質(zhì)等電點。,1、利用已知等電點標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的等電點為縱坐標(biāo)，距正極的距離為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)

11、曲線，在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)待測樣品的位置求出其等電點；,2024/2/27,30,2、利用微電極直接測定凝膠表面的pH而得知樣品的等電點；,3、將凝膠切成等距離(5nm)的小塊，浸于水中，用精密試紙測定pH。以凝膠塊距正極的距離為橫坐標(biāo)，pH為縱坐標(biāo)作用圖得出膠的pH梯度曲線。根據(jù)待測樣品在凝膠中的位置而得出蛋白質(zhì)樣品的等電點。,2024/2/27,31,其它蛋白質(zhì)定性定量分析技術(shù),蛋白質(zhì)的電泳染色定量分析,特定蛋白質(zhì)在總蛋白中所點比例的

12、分析：最早應(yīng)用于血漿蛋白電泳分離后白蛋白和球蛋白的比例測定。其方法有二，其一是將染色后的蛋白區(qū)帶剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛『蟊壬珳y定；其二用反射掃描儀處理后，計算各峰面積比而得出各成分的相對含量。,與已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白一起電泳染色掃描后與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較，得出樣品蛋白的含量。,2024/2/27,32,2024/2/27,33,2024/2/27,34,2024/2/27,35,免疫印跡技術(shù)的基本操作(例PKC),1、細(xì)胞裂解物的制備,2、細(xì)胞