紫外分光光度法

1、紫外-可見分光光度法講議,,第一節(jié) 紫外-可見分光光度法,研究物質(zhì)在紫外光、可見光光區(qū)的分子吸收光譜的分析方法稱為紫外-可見分光光度法。 紫外—可見分光光度法是利用某些物質(zhì)的分子吸收在200 ~ 800 nm光譜區(qū)的輻射來進(jìn)行分析測定的方法，廣泛用于無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定性和定量測定。,第二節(jié) 光吸收基本定律和吸收系數(shù),1.光吸收基本定律： 比爾—郎伯（Beer—Lambert）定律為光吸收基本定律，

2、是分光光度分析的理論基礎(chǔ)。 Lambert于1730年提出了光強(qiáng)度與吸收介質(zhì)厚度的關(guān)系。1852年Beer提出了光強(qiáng)度與吸收介質(zhì)中吸光物質(zhì)濃度之間的關(guān)系。,透光率： 單色光通過一物質(zhì)的溶液時透過光的強(qiáng)度（I）與入射光的強(qiáng)度（I0)之比稱為透光率或透射比（T）。 T ＝ I ／ I0吸收度： 透光率的負(fù)對數(shù)稱為吸收度或光密度。

3、 A=log1/T=－logT,郎伯（Lambert）定律: 當(dāng)溶液濃度不變時，吸收度與溶液的液層厚度成正比。比爾（Beer）定律： 當(dāng)溶液液層厚度不變時，吸收度與溶液的濃度成正比。,郎伯—比爾（Lambert— Beer ）定律: 單色光通過一物質(zhì)的溶液時，如果入射光的強(qiáng)度不變，溶液吸收度（A）與溶液濃度（C）和液層厚度（L）成正比。 A=log1/T=EC

4、L 式中E為吸收系數(shù),2.吸收系數(shù)： 定義：吸光物質(zhì)在單位濃度和單位液層厚度時的吸收度。 表示方法：（1）百分吸收系數(shù)（E）： 當(dāng)溶液濃度（C）為1%（g/ml），光路長度（L）為1cm時，相應(yīng)的吸收度為百分吸收系數(shù)，以E表示。 E=A/C(%)×L(cm)中國藥典規(guī)定的吸收系數(shù)即為E。,（2）摩爾吸收系數(shù)（ε）： 當(dāng)溶液的

5、濃度（C）為1mol/L,光路長度（L）為1cm時，相應(yīng)的吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)，以ε表示。 　　 ε =A/C(mol/L)×L(cm)ε和E的關(guān)系是： ε=E×分子量/10 E= ε ×10/分子量,第三節(jié).分光光度計組成,基本原理框圖：,光 源,單色器,吸收池,檢測器,訊號處理及顯示器,,,,,（一）光源,可見光區(qū)，常用鎢燈做為光源，可使用的范圍在340 ~ 2500

6、nm?！　∽贤夤鈪^(qū)，常用氫燈或氘燈做為光源?？墒褂玫姆秶?60 ~ 375 nm?！　x器必須配有穩(wěn)壓裝置。,（二）單色器,單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的波長且波長在紫外可見區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)。　　　能產(chǎn)生單色光的色散元件主要是: 棱鏡和光柵。,（三.）吸收池： 吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。

7、在高精度的分析測定中（紫外區(qū)尤其重要），吸收池要挑選配對。因為吸收池材料本身的吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析結(jié)果都有影響。,玻璃吸收池因為能吸收紫外光，故只能用于320nm以上的可見光區(qū)?！　　∈⑽粘匾虿晃兆贤夤舛Ｓ糜?00nm以下的紫外光區(qū)，但也可用于可見光區(qū)。 最常用的光路長度為: 1cm的吸收池。,（四.）檢測器： 檢測器的功能是檢測信號、測量單色光透過溶液后光強(qiáng)度變化，是

8、將光信號轉(zhuǎn)換成電信號的一種裝置。,紫外－可見分光光度計的校正,波長校正－用汞燈、氘燈、鈥玻璃吸光度準(zhǔn)確度－用重鉻酸鉀的硫酸溶液雜散光檢查－1%碘化鈉溶液、5%亞硝酸鈉溶液,第四節(jié) 樣品測定操作方法,一.吸收系數(shù)測定（性狀項下）: 按各該品種項下規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長測定其吸收度，并計算吸收系數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定范圍。,二.鑒別及檢查: 按各該品種項下的規(guī)定，測定供試品溶液在有關(guān)波長處的最大及

9、最小吸收，有的并須測定其各最大吸收峰值或最大吸收與最小吸收的比值，均應(yīng)符合規(guī)定。,三.含量測定:1.對照品比較法 : 按各該品種項下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分標(biāo)示量的（100士10）％以內(nèi)，用同一溶劑，在規(guī)定的波長處測定供試品溶液和對照品溶液的吸收度。,2.吸收系數(shù)法 按各該品種項下配制供試品溶液，在規(guī)定的波長及該波長士２nm處測定其

10、吸光度，按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計算含量。 采用吸收系數(shù)法應(yīng)對儀器進(jìn)行校正后測定。,3.計算分光光度法 采用計算分光光度法的品種，應(yīng)嚴(yán)格按各該品種項下規(guī)定的方法進(jìn)行，用本法時應(yīng)注意：有一些吸光度是在供試品或其成分吸收曲線的上升或下降陡坡部處測定，影響精度的因素較多，故應(yīng)仔細(xì)操作，盡量使測定供試品和對照品的條件一致，若該品種不用對照品，如維生素A測定法（見中國藥典附錄），則應(yīng)在測定前對儀器作仔細(xì)的

11、校正和檢定,第五節(jié) 注意事項,1.試驗中所用的量瓶，移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。2.使用的石英吸收池必須潔凈。吸收池在測定樣品溶液前必須加以校正。 取吸收池時，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝盛樣品溶液以池體積的4／5為度。 使用揮發(fā)性溶液時應(yīng)加蓋。吸收池透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無殘留溶劑。,吸收池放入樣品室時應(yīng)注意每次放入方向相同。吸收池使用后應(yīng)用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存。吸收池如污染不易洗凈

12、時可用硫酸發(fā)煙硝酸（3:1V/V）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時，吸收池不宜在清潔液中長時間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會損壞吸收池的光學(xué)表面，并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。,3. 測定前應(yīng)先檢查所用的溶劑在測定供試品所用的波長附近是否符合要求。 可用1cm石英吸收池盛溶劑以空氣為空白（即參比光路中不放置任何物質(zhì)），測定其吸光度，應(yīng)符合下表規(guī)定。 所用溶劑應(yīng)不超過其截止使用波長。

13、 每次測定時所用的溶劑，應(yīng)采用同一廠牌批號，混合均勻的溶劑。,對溶劑的要求,溶劑的使用范圍不能小于截至使用波長，如甲醇、乙醇的截至使用波長是205nm。在使用前應(yīng)檢查所用溶劑在供試品測定的波長處是否符合要求（以空氣為空白）。220～240nm 吸光度≤0.40241～250nm 吸光度≤0.20251～300nm 吸光度≤0.10300nm以上 吸光度≤0.05,4 .稱量應(yīng)按藥典規(guī)定

14、要求。配制測定溶液時稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少，轉(zhuǎn)移稀釋時所取溶積一般應(yīng)不少于5ml。含量測定供試品應(yīng)稱取2份，如為對照品比較法，對照品一般也應(yīng)稱取2份，平行操作，每份結(jié)果對平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以內(nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。,5. 供試品測試溶液的濃度，除各該品種項下已有注明者外，供試品溶液的吸光度以在0.3～0.7之間為宜，吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小，并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸收度線性范圍，配制合適的讀數(shù)濃度。,6.選用儀器的狹

15、縫譜帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測得的吸光度值會偏低，狹縫寬度的選擇應(yīng)以減小狹縫寬度時供試品的吸光度不再增加為準(zhǔn)，對于中國藥典紫外測定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但對某些品種如青霉素鉀及鈉的吸光度檢查則需用1nm縫寬或更窄，否則其264nm的吸光度會偏低。,7 .測定時除另有規(guī)定者外，應(yīng)在規(guī)定的吸收峰±2nm處，再多測幾個點的吸光度，以核對供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸光度最大的波長作為測定波長。除另有規(guī)定

16、外吸光度最大波長應(yīng)在該品種項下規(guī)定的波長±２nm以內(nèi)，否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長的準(zhǔn)確度。,第七節(jié) 檢驗記錄單內(nèi)容,檢品名稱：多潘立酮片 批 號：070524檢品編號：200703634 檢驗項目：含量測定檢驗依據(jù)：中國藥典2005年版二部附錄ⅣA 紫外分光光度計編號： 檢驗日期：天平編號： 稱量日期：室 溫：

17、 相對濕度：檢測條件：檢測波長 nm 狹縫寬度 2.0 nm標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：含多潘立酮應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110.0％空白溶劑檢查,第七節(jié) 檢驗記錄單內(nèi)容,對照品溶液配制：取多潘立酮對照品約12.5mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加水2.5ml與異丙醇12.5 ml，置水浴上加熱溶解，冷卻，加異丙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置25 ml量瓶中，加異丙醇至刻度, 振搖。供試品溶液配制：

18、取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約相當(dāng)于多潘立酮10mg的量，置50ml量瓶中，加水5ml，振搖，加異丙醇25 ml，置水浴上加熱10分鐘并時時振搖使溶解，放冷，加異丙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加異丙醇至刻度, 振搖。,第七節(jié) 檢驗記錄單內(nèi)容,測定方法：取上述二溶液，在288nm的波長處分別測定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱: 批號：