理化因素對(duì)微生物的影響;細(xì)菌的生長現(xiàn)象與生化反應(yīng)

1、實(shí)驗(yàn)四 理化因素對(duì)微生物的影響；細(xì)菌的生長現(xiàn)象與生化反應(yīng)基礎(chǔ)部微生物學(xué)教研室,[教學(xué)目標(biāo)] 1.了解細(xì)菌代謝產(chǎn)物的生化檢查方法。2.熟悉常見的物理化學(xué)因素對(duì)細(xì)菌生長的影響。3.熟悉細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感試驗(yàn)方法與步驟。4.掌握細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象。,教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)：重點(diǎn)：細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象。難點(diǎn)：藥敏試驗(yàn)的判斷，細(xì)菌常見的代謝產(chǎn)物并分析其生化反應(yīng)現(xiàn)象的意義,【材料】

2、 血液瓊脂平板培養(yǎng)基、滅菌棉拭、接種環(huán)、酒精燈。紫外線燈、2.5％碘酒、75％乙醇、1％龍膽紫、2％紅汞、1:1000新潔爾滅、無菌濾紙片、葡萄球菌培養(yǎng)液、大腸埃希菌培養(yǎng)液、瓊脂平板、無齒小鑷子。 抗生素紙片(青、鏈、氯、慶大霉素、磺胺等)。,教學(xué)基本內(nèi)容：一、觀看錄像：消毒滅菌二、 講解紫外線殺菌的原理，抗生素敏感實(shí)驗(yàn)的原理與操作三、操作講解與示范：觀察細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中

3、的生長現(xiàn)象。檢查細(xì)菌常見的代謝產(chǎn)物并分析其生化反應(yīng)現(xiàn)象的意義。四、學(xué)生動(dòng)手操作,一、觀看錄像：消毒滅菌,二、消毒滅菌試驗(yàn) 講解紫外線殺菌的原理；抗生素敏感實(shí)驗(yàn)的原理與操作,消毒與滅菌方法,加熱滅菌干熱滅菌濕熱滅菌過濾除菌輻射滅菌放射線輻照滅菌紫外線滅菌化學(xué)藥品滅菌,干熱滅菌,干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水

4、量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160～170℃），時(shí)間要長（1～2h），但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。,,,微孔濾膜過濾除菌,過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。微孔濾膜過濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口處可連接針筒，使

5、用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過濾除菌。,,（一）煮沸與高壓滅菌法【原理】 高溫對(duì)細(xì)菌有明顯的致死作用，主要機(jī)制是凝固菌體蛋白質(zhì)，也可能與細(xì)菌DNA單螺旋斷裂、細(xì)菌細(xì)胞膜功能受損及菌體內(nèi)

6、電解質(zhì)濃縮有關(guān)。濕熱滅菌法所需溫度比干熱法為低，時(shí)間較短。尤其是高壓蒸氣滅菌，因增加壓力而提高沸點(diǎn)，滅菌效果最佳。有芽胞的細(xì)菌由于對(duì)熱的抵抗力比無芽胞細(xì)菌強(qiáng)，所以只有采用高壓蒸氣滅菌法才能將芽胞徹底殺滅。,,【材料】瓊脂平板兩塊、肉湯管兩支、大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌肉湯培養(yǎng)物。【方法】 ①取瓊脂平板兩塊，用記號(hào)筆分別在二平板底部玻面上，注明大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌，并分別將二塊平板底玻璃面劃分三等份，于每塊平板的三等份上

7、分別注明對(duì)照、加熱100℃ 10min及加熱121℃ 20min。,,②取肉湯管二支，分別注明加熱100℃ l0min及加熱121℃ 20min，用毛細(xì)吸管吸取大腸埃希菌肉湯培養(yǎng)物，于上述二支肉湯管中各加入菌液一滴。混勻，再用接種環(huán)于二支肉湯管的任何一管中取一環(huán)菌液接種于大腸埃希菌平板的對(duì)照處，然后分別將肉湯管加熱100℃ l0min及加熱121℃ 20min(高壓蒸氣15磅、20min)，再各取一接種環(huán)分別接種于平板的相應(yīng)部位?？莶菅?/p>

8、胞桿菌以同法試驗(yàn)。③將二塊瓊脂平板接種物置37℃培養(yǎng)24小時(shí)，比較培養(yǎng)基上二種細(xì)菌的生長情況。,【結(jié)果觀察】（填表）表: 煮沸和高壓滅菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌名稱 100℃ 10分鐘 121℃ 20分鐘 未加熱(對(duì)照)枯草芽胞桿菌大腸埃希菌,（二）紫外線殺菌法【原理】波長265～266nm的紫外線因與DNA吸收光譜-致而有明顯的殺菌作用。其機(jī)制是使細(xì)菌DNA相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而破壞DNA構(gòu)型，干擾其正常復(fù)

9、制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。紫外線殺菌力雖強(qiáng)，但穿透力弱，故只能用于實(shí)驗(yàn)室、病房或手術(shù)室內(nèi)空氣及物體表面的消毒滅菌。另外，殺菌波長的紫外線對(duì)人體皮膚、眼睛等有損傷作用，應(yīng)注意防護(hù)。,【材料】大腸埃希菌培養(yǎng)物、瓊脂平板、接種環(huán)、酒精燈、紫外線燈。【方法】①以滅菌接種環(huán)挑取大腸埃希菌培養(yǎng)物，于瓊脂平板上作來回密集劃線接種。②半啟皿蓋(將皿蓋遮住涂面的1／2)，置于紫外線燈下lm以內(nèi)接受照射30分鐘。③蓋上皿蓋，于37℃培養(yǎng)2

10、4小時(shí)后觀察結(jié)果。,【結(jié)果觀察】（填空） 平板上用黑紙遮蓋部分 菌生長，未遮蓋部分 菌生長。這說明紫外線具有 作用，但 力弱。,（三）化學(xué)消毒法1、皮膚消毒試驗(yàn)【原理】乙醇可使菌體蛋白脫水凝固或與菌體蛋白、酶蛋白等結(jié)合而使之變性失活。70％～75 ％乙醇在15～30秒即將細(xì)菌殺死。但95％的乙醇消

11、毒效果反不如70％～75％為好，因高濃度乙醇使菌體蛋白表面迅速凝固，影響乙醇繼續(xù)進(jìn)入菌體內(nèi)發(fā)揮作用。2.5％的碘酒可使菌體酶蛋白中的硫氫基(-SH)改變，使酶失去活性，導(dǎo)致機(jī)能障礙而死亡。,【材料】普通瓊脂平板一個(gè)、2.5％碘酒、75％乙醇?！痉椒ā咳∑胀ō傊桨逡粋€(gè)，用蠟筆在平板背面玻璃上劃成五等分，并貼上標(biāo)簽；兩人用手在培養(yǎng)基上各涂一格，然后用2.5％碘酒、75％乙醇消毒手指后再各涂另一格，留一格作對(duì)照，蓋好平板，置37℃

12、溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果。,【結(jié)果】（填表）　 皮膚消毒試驗(yàn)結(jié)果,,2、 化學(xué)消毒劑對(duì)細(xì)菌的影響【原理】有些化學(xué)藥品濃度高時(shí)能殺滅病原微生物，稱為化學(xué)消毒劑；濃度低時(shí)能抑制細(xì)菌生長，稱為防腐劑。由于化學(xué)消毒劑對(duì)人體細(xì)胞往往具有毒性作用，故只能外用。不同細(xì)菌對(duì)不同的化學(xué)消毒劑具有不同的敏感性。,,【材料】1％龍膽紫、2％碘酒、2％紅汞、1:1000新潔爾滅、無菌濾紙片、葡萄球菌培養(yǎng)液

13、、大腸埃希菌培養(yǎng)液、瓊脂平板、無齒小鑷子?！痉椒ā咳…傊桨鍍蓧K，分別在其底部注明葡萄球菌及大腸埃希菌。同時(shí)將每塊平皿底部玻璃面劃分4等分，并分別標(biāo)明龍膽紫、碘酒、紅汞、新潔爾滅。(操作方法與藥敏試驗(yàn)相似),,三、抗生素的抗菌試驗(yàn)(藥敏試驗(yàn)，紙片法)【原理】抗生素主要是指某些微生物(大多數(shù)為放線菌和真菌、極少數(shù)為細(xì)菌)在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一種合成代謝產(chǎn)物。此種有機(jī)化合物具有抗生物作用，能抑制或殺滅某些生物細(xì)胞，主要是一

14、些微生物和腫瘤細(xì)胞。一種抗生素只對(duì)一定種類的生物細(xì)胞具有選擇性拮抗作用，這種作用范圍稱為抗菌譜?？股氐目咕囼?yàn)(藥敏試驗(yàn))是指在體外測定藥物抑制或殺死細(xì)菌能力的試。,為正確使用抗生素，臨床上常在分離致病細(xì)菌的同時(shí)做藥物敏感試驗(yàn)，以了解該細(xì)菌對(duì)常用各種抗生素的敏感性。提高治療的針對(duì)性。同時(shí)，減少患者的痛苦，減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 藥敏試驗(yàn)的常用方法：紙片法,,【方法】①取瓊脂平板培養(yǎng)基二塊，于其底部玻璃上用標(biāo)簽紙注明本人所

15、接種的菌株名稱（或?qū)⑵桨宓撞恳韵灩P劃為六等分，分別在靠近邊緣處注明青、鏈、氯、慶大等字樣）。,②以滅菌接種環(huán)挑取菌液，在培養(yǎng)基表面作密集劃線接種。③將鑷子火焰滅菌，待冷后再取各藥物紙片，分別牢貼于種有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面相應(yīng)位置，每次貼片后鑷子均應(yīng)經(jīng)火焰燒灼滅菌。每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm，并分別作好標(biāo)記。,,在直徑90mm的平板上均勻擺放藥敏紙片的樣板④37℃孵育18～24h后，分別測量各

16、紙片抑菌環(huán)直徑(包括紙片在內(nèi))(mm)，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長為限。判定其敏感度。,,【材料】①金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、瓊脂平板培養(yǎng)基。②抗生素紙片(青、鏈、氯、慶大霉素、磺胺等)、尖頭鑷子、酒精燈、接種環(huán)?！痉椒ā竣偃…傊桨迮囵B(yǎng)基二塊，于其底部玻璃上用標(biāo)簽紙注明本人所接種的菌株名稱（或?qū)⑵桨宓撞恳韵灩P劃為六等分，分別在靠近邊緣處注明青、鏈、氯、慶大等字樣。操作： 1） 抗生素敏感試驗(yàn)（普通

17、平板 2塊/3人） 2）抗生素紙片(青霉素、鏈霉素、慶大霉素、黃連素 1套/6人) 3）大腸桿菌、敏感金葡菌培養(yǎng)物（1支/6人）,藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果判斷參考標(biāo)準(zhǔn)：,,敏感：表示常規(guī)劑量的藥物在體內(nèi)所達(dá)到的濃度能抑制或殺滅待測菌；中度敏感：指提高測定藥物的劑量或在該藥物濃集部位，細(xì)菌生長可被抑制；耐藥：表示常規(guī)劑量的藥物在體內(nèi)所達(dá)到的濃度不能抑制或殺滅待測菌。,【結(jié)果觀察記錄】填表藥物敏感試驗(yàn)(紙片擴(kuò)散法)結(jié)果,思考題