hplc定量分析方法

1、,HPLC法,高效液相色譜法,High performance liquid chromatography (HPLC),了解HPLC色譜儀的構(gòu)成熟悉HPLC法分類及方法掌握HPLC法的定義、特點(diǎn)掌握HPLC法實(shí)驗(yàn)條件的選擇掌握HPLC法的定量分析方法,教學(xué)大綱,用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入進(jìn)樣閥的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色

2、譜信號(hào)。,HPLC法的定義、特點(diǎn),一、定義,二、特點(diǎn),1.適用范圍廣（可分析80%有機(jī)化合物）2.分離性能好3.分析速度快4.靈敏度高5.色譜柱可反復(fù)使用6.流出組分容易收集,,,©2006,Baidu 免責(zé)聲明 與百度對(duì)話,HPLC實(shí)驗(yàn)條件的選擇,1. HPLC前處理2. 色譜柱的選擇3. 流動(dòng)相的選擇4. 洗脫方式的選擇5. 檢測(cè)器的選擇,HPLC前處理,1. 流動(dòng)相的處理2. 樣品的處理,流動(dòng)相的處理

3、,1. 溶劑的純化2. 流動(dòng)相脫氣3. 過濾,4. 色譜純?cè)噭?. 重蒸水,流動(dòng)相的處理,過濾：除去固體微粒,親水、親脂、兩用；0.45µm,流動(dòng)相的處理,,流動(dòng)相脫氣,脫氣：除去流動(dòng)相中的空氣方法：超聲波振蕩脫氣、惰性氣體鼓泡吹掃脫氣、抽真空、加熱脫氣、在線脫氣系統(tǒng),樣品的處理,除去雜質(zhì)、純化樣品濃縮樣品或進(jìn)行衍生化過濾,HPLC前處理,樣品的處理 供試品溶液的制備,,提取,純化,,濃縮 or 衍生化,,H

4、PLC樣品,,處方,劑型,待測(cè)成分的理化性質(zhì),干擾成分的理化性質(zhì),色譜柱的選擇,根據(jù)被分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解度,色譜柱的長(zhǎng)度與分離效果,正相色譜柱：固定相極性大于流動(dòng)相，一般指硅膠柱，以正己烷系列為流動(dòng)相。正相色譜法主要用于分離分析能溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性分子型物質(zhì),,色譜柱的分類,反相色譜柱：固定相極性小于流動(dòng)相，其技術(shù)就是在硅膠基質(zhì)上鍵合有機(jī)碳鏈。一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水為流動(dòng)相。 反相色譜法

5、適用于非極性及中等極性化合物目前用的最多的色譜柱是反相鍵合相色譜柱 最常用：（octadecylsilane) ODS柱/C18 （十八烷基鍵合相）,,色譜柱的分類,鍵合相的優(yōu)點(diǎn),①使用過程不流失②化學(xué)性能穩(wěn)定，在PH2-8的溶液中不變質(zhì)③熱穩(wěn)定性好，一般在70℃以下穩(wěn)定④載樣量比硅膠約大一個(gè)數(shù)量級(jí)⑤適于作梯度洗脫,,,,,避免壓力和溫度的急劇變化和任何機(jī)械震動(dòng)樣品要進(jìn)行預(yù)處理；在分析柱前安裝保護(hù)柱（如分析柱是鍵合硅

6、膠，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解）流動(dòng)相要適宜，不能對(duì)固定相產(chǎn)生破壞注意色譜柱的pH使用范圍、耐壓限度注意色譜柱的方向性，色譜柱不能反沖（除非指明）,色譜柱的使用和維護(hù),每次色譜分析完成后，要及時(shí)對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗保存色譜柱在合適的溶劑中（應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長(zhǎng)時(shí)間。）,色譜柱的使用和維護(hù),流動(dòng)相的

7、選擇,固定相一定時(shí)，流動(dòng)相的種類、配比、pH值及添加劑等能顯著影響分離效果，HPLC中流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要。,對(duì)流動(dòng)相的基本要求,①不與固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)②對(duì)樣品有適宜的溶解度 要求容量因子k在2～5 (最佳) 或1～10 (可用) k值太小，不利于分離；k值太大，可能使樣品在流動(dòng)相中沉淀③必須與檢測(cè)器相適應(yīng) 例如用紫外檢測(cè)器時(shí)避免末端吸收④粘度小,容量因子(capacity factory):也稱為分配容量（

8、partition volume）、容量比（capacity ratio），是在達(dá)到分配平衡后，組分在固定相中的量與流動(dòng)相中的量之比。也稱為質(zhì)量分配系數(shù)。,流動(dòng)相的選擇,反相鍵合相色譜正相鍵合相色譜反相離子對(duì)色譜,鍵合相色譜法：化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，分離機(jī)制以分配作用為主，對(duì)不封尾的鍵合相還有一定的吸附作用。應(yīng)用最廣泛的色譜法,用化學(xué)反應(yīng)將鍵合相的載體硅膠的殘存硅醇基去掉的方法，稱為封尾或遮蓋（end-capping）,形

9、成的鍵合相稱為封尾鍵合相。,反相鍵合相色譜流動(dòng)相的選擇,1.部分含水溶劑：水為基礎(chǔ)溶劑，再加入可與水互溶的有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑（如甲醇、乙腈、四氫呋喃） 適用于分離中等極性、弱極性藥物 常用甲醇－水、乙腈－水系統(tǒng) 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)及其與水的比例對(duì)保留值和分離選擇性有影響,反相鍵合相色譜流動(dòng)相的選擇,2.緩沖溶液常用的緩沖液：三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液。適用于可溶于水并具可解離特性的化合物，如蛋白質(zhì)及弱酸、弱堿類化合物。緩

10、沖液及PH不同、及所占比例不同會(huì)影響組分的保留值,注意,由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸縮狀態(tài)，故對(duì)于C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5％，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定,,,,反相鍵合相色譜流動(dòng)相的選擇,3.非水溶劑流動(dòng)相為不含水系統(tǒng)。用于分離疏水性物質(zhì)。在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氫呋喃。這種色譜法稱為非水反相色譜法。,正相鍵合相色譜流動(dòng)相的選擇,流動(dòng)相采用飽

11、和烷烴（如正己烷）中加入極性較大的溶劑為極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醚），通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度來改變?nèi)軇?qiáng)度。,反相離子對(duì)色譜流動(dòng)相的選擇,是極性較強(qiáng)的水系統(tǒng)混合溶劑最常用的是甲醇－水、乙腈－水中加入0.003-0.01mol/L的離子對(duì)試劑離子對(duì)試劑的性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相的PH及流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的性質(zhì)和比例都會(huì)影響組分的保留值和分離效果,洗脫方式的選擇,等度洗脫梯度洗脫,1洗脫的類型等度洗脫 在一個(gè)分析周期內(nèi)流動(dòng)相的組成保持恒

12、定 適合于組分?jǐn)?shù)目較少、性質(zhì)差別不大的樣品,洗脫方式的選擇,葛根芩連湯中葛根素的含量,流動(dòng)相: 甲醇：乙腈：水(12∶8∶80)流速: 1.0 mL/min 柱溫: 室溫,1、洗脫的類 梯度洗脫 在一個(gè)分析周期中，程序控制流動(dòng)相的組成改變（如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、pH值等），使每個(gè)組分都在適宜的條件下獲得分離。 適合于組分?jǐn)?shù)目較多、組分間k值相差較大（10-100倍）的復(fù)雜混合物,洗脫方式的選擇,優(yōu)點(diǎn)

13、縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形。使峰變尖銳，使微量組分容易被檢出，提高檢測(cè)靈敏度缺點(diǎn) 常常會(huì)引起基線漂移，重現(xiàn)性較等度洗脫差,2、梯度洗脫的特點(diǎn),梯度洗脫的特點(diǎn),標(biāo)準(zhǔn)品,樣品,HPLC梯度洗脫條件,1.要注意溶劑的互溶性，不相混容的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相2.所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性3.混合溶劑的粘度常隨組成而變化4.每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10-30倍柱

14、容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡,2、梯度洗脫的特點(diǎn),梯度洗脫需注意內(nèi)容,檢測(cè)器的選擇,分 類,1.紫外檢測(cè)器（ultraviolet detector;UV)2.熒光檢測(cè)器（fluorophtometric detector;FD)3.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector; ELSD)4.電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemical detec

15、tor；ECD)5.示差折光檢測(cè)器（differential refractive index detector；DRID）6.化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器（chemiluminescence detector;CLD)7.質(zhì)譜檢測(cè)器(mass spectrometry detector;MSD),檢測(cè)器的選擇,1.優(yōu)點(diǎn)靈敏度高，最低檢出量可達(dá)10-7～10-12 g 不破壞樣品，可用于制備 對(duì)溫度及流動(dòng)相波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫,紫外

16、檢測(cè)器（最普遍）,2.缺點(diǎn)只能檢測(cè)具有紫外吸收或衍生物具有紫外吸收的 物質(zhì)流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)必須小于檢測(cè)波長(zhǎng),紫外檢測(cè)器（最普遍）,3.種類⑴可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器（UVD）配制最多,⑵光電二極管陣列檢測(cè)器 （photodiode array detector; PDAD或DAD）,紫外檢測(cè)器（最普遍）,,特點(diǎn) 可以快速掃描被測(cè)組分的的紫外可見吸收光譜?？梢酝瑫r(shí)獲得樣品的色譜圖及每個(gè)組分的吸收光譜。特殊功能 a

17、、色譜峰的準(zhǔn)確定性 b、峰純度檢驗(yàn) c、多通道檢測(cè) d、峰抑制 e、寬譜帶檢測(cè) f、選擇最佳波長(zhǎng),光電二極管陣列檢測(cè)器,a、色譜峰的準(zhǔn)確定性 先取得該峰的光譜圖,再與標(biāo)準(zhǔn)樣品的光譜圖進(jìn)行比較,若兩個(gè)光譜完全重合,說明是同一種物質(zhì);若不重合,說明是不同種物質(zhì)。,,光電二極管陣列檢測(cè)器,,,,光電二極管陣列檢測(cè)器,b、峰純度檢驗(yàn) 在色譜分析中,通常

18、利用吸收比確定峰的純度。二極管陣列檢測(cè)器既可使用吸收比的方法,又可使用比較光譜的方法。在峰的前沿、后沿和最大值處各取一點(diǎn),掃出這三點(diǎn)的光譜圖進(jìn)行比較,若三個(gè)光譜圖完全重合,說明是純峰(只含一種物質(zhì)) ,若不完全重合,說明峰中含有雜質(zhì)。,對(duì)于任何在紫外-可見光區(qū)有吸收的純物質(zhì)在兩個(gè)選定波長(zhǎng)下的吸收比為一常數(shù)，且與濃度無關(guān),,,d、峰抑制 如果兩種化合物沒有完全分離,但它們的光譜圖有很大差別,就可以通過選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)、參考波長(zhǎng)和

19、帶寬,使一種化合物被完全抑制。,光電二極管陣列檢測(cè)器,1.優(yōu)點(diǎn)靈敏度極高，比紫外檢測(cè)器高一個(gè)數(shù)量級(jí)良好的選擇性線性范圍較寬受外界條件影響較小只要選作流動(dòng)相的溶劑不發(fā)熒光，熒光檢測(cè)器就能用于梯度洗脫高靈敏度和高選擇性，適于體內(nèi)藥物分析,熒光檢測(cè)器,2.缺點(diǎn)只適于檢測(cè)能產(chǎn)生熒光或衍生物能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。應(yīng)用不如紫外檢測(cè)器廣流動(dòng)相不能含有熒光物質(zhì)或使熒光熄滅的物質(zhì),應(yīng)用：氨基酸、多環(huán)芳烴、甾體化合物、酶,熒光檢測(cè)器,蒸發(fā)光散

20、射檢測(cè)器,色譜柱后流出液（流動(dòng)相+組分）先引入已通氣體（常用高純氮或空氣）的霧化器，流出物與通入的氣體形成均勻的微小液滴，經(jīng)過蒸發(fā)器（漂移管）加熱，蒸發(fā)除去流動(dòng)相，而樣品組分在蒸發(fā)器內(nèi)形成氣溶膠，然后進(jìn)入檢測(cè)室。用強(qiáng)光或激光照射氣溶膠而產(chǎn)生光散射（丁鐸爾效應(yīng)），用光電二級(jí)管檢測(cè)散射光強(qiáng)度，從而獲得組分的濃度信號(hào)。散射光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)與組分質(zhì)量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,1.優(yōu)點(diǎn)通用型檢測(cè)器。對(duì)各種物質(zhì)幾乎都有響應(yīng)靈敏度比示差折

21、光檢測(cè)器高流動(dòng)相系統(tǒng)溫度變化影響不敏感可進(jìn)行梯度洗脫沒有流動(dòng)相的紫外吸收干擾,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,2.缺點(diǎn)分析范圍受樣品組分和流動(dòng)相揮發(fā)性的限制流動(dòng)相中如含緩沖溶液，緩沖溶液必須受到限制：必須是揮發(fā)性，并且濃度應(yīng)盡可能低，不能用含緩沖鹽的流動(dòng)相。通常選用的緩沖溶液有：甲酸、乙酸、三氟乙酸等是一種破壞型檢測(cè)器，不能配備制備型的高效液相儀進(jìn)行樣品的純化制備比紫外檢測(cè)器靈敏度低,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,3.在中藥分析中的應(yīng)用中藥的化學(xué)

22、成分復(fù)雜，有一部分成分不存在紫外吸收或僅在紫外末端有吸收。紫外檢測(cè)器難于檢測(cè)。ELSD在某種程度彌補(bǔ)了這方面的不足用于糖類、氨基酸、甾體等化合物,黃芪：黃芪甲苷，200.8nm末端紫外吸收,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,,,,電導(dǎo)檢測(cè)器：用于離子色譜極譜檢測(cè)器庫侖檢測(cè)器安培檢測(cè)器,電化學(xué)檢測(cè)器,,伏安檢測(cè)器,,能氧化、還原的物質(zhì),,檢測(cè)限達(dá)10-12 g /ml，痕量組分分析,特點(diǎn)：通用型檢測(cè)器對(duì)多數(shù)物質(zhì)的靈敏度低（約10-5 g /m

23、l），不能用于痕量分析適合于糖類的檢測(cè)（檢測(cè)限可達(dá)10-8g /ml）受環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成等波動(dòng)的影響大，不適合梯度洗脫,示差折光檢測(cè)器,高選擇性、高靈敏度的新型檢測(cè)器是分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺的最佳選擇,化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器,HPLC-MS能提供的質(zhì)譜信息準(zhǔn)確的化合物分子量信息未知化合物碎片結(jié)構(gòu)信息一套完整的圖譜和多種掃描方式充分提供定性、定量和峰純度信息可用于無共價(jià)鍵、無功能團(tuán)的化合物,質(zhì)譜檢測(cè)器,幾種檢測(cè)器的主要性能,

24、化學(xué)鍵合相色譜法 BPC（最廣泛）膠束色譜法 MC手性色譜法 CC,HPLC法分類及方法,借助于化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的表面而構(gòu)成化學(xué)鍵合相。,化學(xué)鍵合相色譜法,反相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法離子對(duì)色譜法離子抑制色譜法,反相鍵合相色譜法,適用于非極性與中等極性的化合物非極性鍵合相：十八烷基鍵合相是最常用的固定相（ODS) 05版藥典一部流動(dòng)相：水+極性調(diào)節(jié)劑,正相鍵合相色譜法,適用于溶于有

25、機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)。如：酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等常用的極性鍵合相：氰基（－CN)、氨基（－NH2)和二醇基(DIOL) 常用的流動(dòng)相：烷烴（常用正己烷）+極性調(diào)節(jié)劑極性調(diào)節(jié)劑：乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等,氰基鍵合相：分離選擇性與硅膠相似，對(duì)雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好選擇性氨基鍵合相：較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力，對(duì)含有甾體、強(qiáng)心苷等官能團(tuán)的化合物有較好的分離能力；與糖類分子的羥基產(chǎn)生選擇

26、性。 氨基柱用作分析糖類的專用色譜柱，但不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等。因?yàn)榇嬖赟chiff堿反應(yīng)。,正相鍵合相色譜法,含義：直接將離子對(duì)試劑加入到流動(dòng)相中，用以分離離子型或可離子化化合物的方法稱為離子對(duì)色譜法。分類：反相離子對(duì)色譜法;正相離子對(duì)色譜法反相離子對(duì)色譜法：以C18或C8鍵合相為固定相，含離子對(duì)試劑的有機(jī)溶媒－水溶液為流動(dòng)相適用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離,離子對(duì)色譜法,1.離子對(duì)試劑的選擇：選用的離子對(duì)試

27、劑的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反。 分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用帶負(fù)電荷的烷基磺酸鹽或烷基硫酸鹽 如：己烷基磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉等 分析酸類或帶負(fù)電荷的物質(zhì)：用帶正電荷的季胺鹽 如：四甲胺、四丁胺、十六烷基三甲胺、三辛胺等 離子對(duì)試劑的濃度一般為：3-10mmol/L,反相離子對(duì)色譜法,2.流動(dòng)相ph值的控制調(diào)節(jié)ph值可在較大范圍內(nèi)改變?nèi)跛?、弱堿樣品的保留值和分離選擇性 因采用的是以硅膠為基體烷基

28、鍵合相，流動(dòng)相的ph應(yīng)在2-8范圍內(nèi)調(diào)整3.有機(jī)溶劑的選擇：甲醇－水；乙腈－水系統(tǒng),反相離子對(duì)色譜法,反相離子對(duì)色譜法特點(diǎn),采用反相鍵合液相色譜柱，在一般的HPLC儀器上就可運(yùn)行，它兼有反相色譜和離子交換色譜共同的優(yōu)點(diǎn)，分析速度快，效率高，操作簡(jiǎn)便。適用于有機(jī)酸、生物堿的分離，以及用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離。缺點(diǎn)：離子對(duì)試劑價(jià)格較貴。,離子抑制色譜法,定義 通過向流動(dòng)相中加入少量弱酸（常用醋酸）、

29、弱堿（常用氨水）、或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽），調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制組分的離解，增加組分在固定相中的溶解度，并改善峰形，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、 弱堿的目的。這種技術(shù)叫離子抑制色譜法。,離子抑制色譜法通常用于反相鍵合相色譜中，組分的保留值除與一般的反相鍵合色譜法有相同的影響因素外，還受流動(dòng)相的pH值影響。流動(dòng)相的PH值要在2-8之間,離子抑制色譜法特點(diǎn),離子抑制色譜法與離子對(duì)色譜法的區(qū)別,1.離子抑制色譜法是向流動(dòng)相中加入抑制劑以抑

30、制組分自身解離。所加抑制劑為低分子有機(jī)或無機(jī)弱酸、弱堿或鹽。抑制子（反離子）是樣品本身所具有的離子。2.離子對(duì)色譜法則是向流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑。離子對(duì)試劑是有機(jī)兩性化合物、表面活性劑。離子對(duì)試劑的反離子與組分離子結(jié)合成中性離子對(duì)。,,一、定量方法二、方法學(xué)建立,HPLC的定量方法,二、方法學(xué)建立,（一）專屬性（二）線性關(guān)系考察（三）精密度試驗(yàn)（四）準(zhǔn)確度試驗(yàn)（五）穩(wěn)定性試驗(yàn)（六）檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)限的測(cè)定,1.根據(jù)被分析樣

31、品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。2.選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格(柱內(nèi)徑及柱長(zhǎng))和選用固定相(粒徑及孔徑)。3.根據(jù)被分析樣品特性選擇合適的檢測(cè)器。 4.優(yōu)化分離操作條件，確定流動(dòng)相的組成、流速及洗脫方法。5.建立分析方法并進(jìn)行驗(yàn)證（方法學(xué)考察）6.樣品分析。由獲得的色譜圖進(jìn)行定性和定量分析。,小結(jié),建立HPLC分析方法的步驟,1.樣品的溶解度樣品溶于非極性有機(jī)溶劑樣品溶于極性有機(jī)溶劑樣品溶于