惡臭假單胞菌M39降解17β-E2代謝途徑初步探究.pdf

1、隨著甾類化合物污染的日益加重，研究甾類化合物的快速降解迫在眉睫。目前對甾類化合物的代謝途徑研究中，雄激素睪丸酮代謝途徑的研究已經(jīng)基本完善，而對于雌激素代謝途徑的研究尚在初步階段。因此，本文選擇從南海污泥篩選得到菌株M39，進(jìn)一步研究17β-雌二醇（17β-E2）的代謝途徑。所獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　利用生理生化、16S rRNA分子鑒定和掃描電鏡等方法，初步確定菌株M39為惡臭假單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，細(xì)胞形態(tài)為桿狀。

2、>　　菌株M39能夠利用17β-E2作為唯一碳源，在第20天生長OD600為0.12，第25天降解率為100％及蛋白含量為50μg/mL。在以17β-E2唯一碳源的培養(yǎng)液中添加1/102216E作為輔助碳源進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)M39利用17β-E2的降解周期縮短，在第6天生長OD600為0.8，第9天降解率為100%，第8天蛋白含量為800μg/mL。通過GC-MS檢測菌株降解17β-E2的代謝中間產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)M39以17β-E2為唯一碳源培養(yǎng)

3、6 h后，檢測到雌酮（E1）的累積；而M39以E1為唯一碳源培養(yǎng)6 h后，檢測到醋酸雌酮（COA-E1）的累積。推測17β-E2先被菌株M39降解為E1，而E1再被降解為COA-E1。
　　通過轉(zhuǎn)錄組和基因組測序分析，篩選出17個可能參與M39降解的基因，并對這些基因進(jìn)行了mRNA相對表達(dá)量驗證。結(jié)果表明，這17個基因可能參與了17β-E2的代謝，其中有12個基因在17β-E2降解初期有上調(diào)表達(dá)。目前尚未見報道微生物中能降解17β

4、-E2的關(guān)鍵基因，僅有文獻(xiàn)推測可能是加氧酶或3β-HSD基因。因此預(yù)測111（3β-HSD）、300（3β-HSD）、3131（雌二醇裂環(huán)雙加氧酶）和4883（雌二醇裂環(huán)雙加氧酶）可能是M39降解17β-E2降解的關(guān)鍵基因。
　　通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建了預(yù)測基因的工程菌株并且驗證了其降解17β-E2的降解率和代謝中間產(chǎn)物。降解率檢測結(jié)果表明，111和300基因降解17β-E2降解率分別為17.7%和79.23%；111、3131和4