食品科學(xué)與工程畢業(yè)論文蛹蟲草菌絲體多糖提取方法的研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　蛹蟲草菌絲體多糖提取方法的研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品科學(xué)與工程

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　摘 要</b><

3、/p><p>　　蛹蟲草屬真菌類物質(zhì)，其菌絲體具有很高的藥用價值和營養(yǎng)價值，尤其是菌絲體中含有的多糖應(yīng)用十分廣泛并有較高的應(yīng)用價值和開發(fā)潛力。</p><p>　　實驗以蛹蟲草菌絲體為原材料，以多糖的提取率為考察指標，比較了熱水浸提法，超聲波提取法和微波提取法對蛹蟲草菌絲體中多糖的提取效果，并利用苯酚－硫酸法測定其多糖含量。實驗結(jié)果表明，熱水浸提法對菌絲體多糖的提取效果最佳，其次是超聲波提取法

4、和微波提取法。并采用正交實驗法對影響有效成份提取的工藝條件進行了優(yōu)化，最終確定蛹蟲草菌絲體多糖提取的最佳工藝條件為：提取溫度80℃，提取時間3h，提取次數(shù)為3次，液料比為10:1。</p><p>　　關(guān)鍵詞：蛹蟲草菌絲體；多糖；提純；正交試驗法</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　As the fungu

5、s substance，the cultured mycelia of Cordyceps militaris has a high medical and nutritional value, especially its polysaccharide has been widely used. It has a high application value and development potential. </p>

6、<p>　　The experiment regards the cultured mycelia of Cordyceps militaris as the research material，the extraction rate of polysaccharides as indicators . To investigate the method applied in the extraction of polysa

7、ccharides in Cordyceps militaris mycelia．Water-extraction method，ultrasonic wave extraction and microwave extraction method were applied in the extraction of polysaccharides． The content of polysaccharides in mycelia was

8、 determined by phenol-vitriol method．The experiment result shows that th</p><p>　　Keywords: cultured mycelia of Cordyceps militaris；polysaccharide； purification；Orthogonal design method</p><p>&

9、lt;b>　　目錄</b></p><p><b>　　摘 要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p>　　第一章 前 言1</p><p>　　第二章 文獻綜述2</p><p>　　2.1 蛹蟲草菌絲體2</p><

10、;p>　　2.1.1 概述2</p><p>　　2.1.2 成分3</p><p>　　2.2 蛹蟲草菌絲體多糖5</p><p>　　2.2.1蛹蟲草菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)6</p><p>　　2.2.2蛹蟲草菌絲體多糖的特點6</p><p>　　2.2.3 蛹蟲草菌絲體多糖的功效7</p&g

11、t;<p>　　2.2.4 蛹蟲草菌絲體多糖的應(yīng)用9</p><p>　　2.3 蛹蟲草菌絲體多糖提取方法9</p><p>　　2.3.1一般提取法9</p><p>　　2.3.2 超聲波提取法10</p><p>　　2.3.3 微波提取法10</p><p>　　2.3.4 熱回流提取法

12、11</p><p>　　2.3.5 分級沉淀法11</p><p>　　2.3.6 超濾膜分離法11</p><p>　　2.3.7 色譜法12</p><p>　　2.3.8 季銨鹽絡(luò)合法12</p><p>　　2.3.9 酸堿提取法12</p><p>　　2.4 蛹蟲草菌絲

13、體多糖的測定方法13</p><p>　　2.4.1 氣相色譜法13</p><p>　　2.4.2 高效液相色譜法13</p><p>　　2.4.3 苯酚-硫酸法13</p><p>　　2.4.4 離子色譜法13</p><p>　　2.4.5 蒽酮比色法13</p><p>

14、　　2.5 國內(nèi)外研究的現(xiàn)狀14</p><p>　　2.6 本論文的研究內(nèi)容及研究意義14</p><p>　　第三章 試驗部分16</p><p>　　3.1 材料與設(shè)備16</p><p>　　3.1.1 原材料16</p><p>　　3.1.2 主要儀器16</p><p&g

15、t;　　3.1.3 主要試劑16</p><p>　　3.2 試驗方法17</p><p>　　3.2.1蛹蟲草菌絲體的培養(yǎng)17</p><p>　　3.2.2蛹蟲草菌絲體的預(yù)處理17</p><p>　　3.2.3蛹蟲草菌絲體多糖的提取工藝18</p><p>　　3.2.4蛹蟲草菌絲體多糖提取方法的比較

16、19</p><p>　　3.2.5蛹蟲草菌絲體多糖提取工藝的優(yōu)化（熱水浸提法）19</p><p>　　3.2.6 蛹蟲草菌絲體多糖的檢測20</p><p>　　3.3 結(jié)果與討論22</p><p>　　3.3.1葡糖糖標準曲線的繪制22</p><p>　　3.3.2 蛹蟲草菌絲體多糖提取方法的比較2

17、3</p><p>　　3.3.3熱水浸提法提取蛹蟲草菌絲體多糖的單因素分析23</p><p>　　3.3.4正交試驗法優(yōu)化熱水浸提法提取蛹蟲草菌絲體多糖27</p><p>　　第四章 結(jié)論與展望28</p><p><b>　　4.1 結(jié)論28</b></p><p><b&g

18、t;　　4.2 展望28</b></p><p><b>　　致 謝30</b></p><p><b>　　參考文獻31</b></p><p><b>　　第一章 前 言</b></p><p>　　蛹蟲草是一種著名的傳統(tǒng)中草藥，性平味甘，具有補腎滋

19、肺、化痰止血的功效。近年來研究結(jié)果表明：蛹蟲草是冬蟲夏草的重要人工替代品，其在降血脂，防治動脈硬化，鎮(zhèn)靜催眠，保護心、腦組織，增強巨噬細胞活性，抗癌、抗菌、抗缺氧、抗炎等方面具有良好的功效。蛹蟲草的藥理藥效作用與天然冬蟲夏草基本一致，甚至要好于天然冬蟲夏草。其子實體中富含蟲草多糖和蟲草素等重要的生理活性成分。</p><p>　　自從1969年，日本學(xué)者千原從香菇子實體中提取出了一種具有抗腫瘤的活性多糖以來，世界

20、便掀起了從真菌中探求抗腫瘤成分的高潮。蛹蟲草菌絲體多糖作為蛹蟲草中重要的活性成分，自然成為了人們研究的熱點。據(jù)報道,蛹蟲草菌絲體所含的多糖是免疫促進物質(zhì)，而且是目前發(fā)現(xiàn)的最佳免疫促進劑之一。因此，蛹蟲草菌絲體多糖備受人們青睞，對其研究也已成為食品科學(xué)、醫(yī)藥、分子生物學(xué)等領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用和研究的熱點。國內(nèi)外的學(xué)者針對蛹蟲草多糖的結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)活性開展了大量的研究工作，而且已經(jīng)證實蛹蟲草多糖具有提高免疫力、抗衰老，對特異性、非特異性、體液免疫和

21、細胞免疫均有顯著增強作用，還有降低血乳酸和血清尿素氮水平的作用。但現(xiàn)階段，蛹蟲草菌絲體多糖產(chǎn)品的開發(fā)仍然很少，其遠遠比不上其他的藥用真菌例如靈芝、冬蟲夏草等。最主要原因的是針對蛹蟲草菌絲體多糖提取技術(shù)研究開發(fā)還較少，無法進行工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。技術(shù)問題是主要克服現(xiàn)有的技術(shù)不足，提供一種低成本，而且對環(huán)境污染小的蛹蟲草菌絲體多糖的提取方法，從而使蛹蟲草多糖能被有效地提取、避免單一的提取給蛹蟲草活性成分帶來損失，以提高蛹蟲草的綜合利用度，降低投

22、資與運行成本，最大限度地發(fā)揮蛹蟲草的</p><p>　　因此，本實驗開展對蛹蟲草菌絲體多糖提取工藝的研究和優(yōu)化，為工業(yè)化規(guī)模性生產(chǎn)蛹蟲草菌絲體多糖提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　第二章 文獻綜述</b></p><p>　　2.1 蛹蟲草菌絲體</p><p><b>　　2.1.1 概述<

23、;/b></p><p>　　由于生長環(huán)境的要求極其特殊而且有嚴格的寄生性，造成冬蟲夏草的資源非常稀少，再加上采收的不易，因而野生的冬蟲夏草十分缺乏。而且由于近幾年對冬蟲夏草無序的濫采濫挖，使其資源面臨崩潰。冬蟲夏草價格昂貴，已經(jīng)數(shù)十甚至數(shù)百倍于參茸等。因此，尋找其他的代用品是勢在必然。隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，研究員們已經(jīng)開始人工培育蛹蟲草，蛹蟲草的培育過程是仿照野生冬蟲夏草的生育條件開展模仿栽培的結(jié)果，其

24、過程為：采用傳統(tǒng)的菌種采集方法，從長白山地區(qū)采集被蛹蟲草真菌感染的、已有成熟子實體、孢子尚沒擴散的昆蟲體進行菌種分離，用斜面純化蛹蟲草菌種，選出穩(wěn)定品質(zhì)優(yōu)良的蛹蟲草菌種，然后采用液體培養(yǎng)方法制成蛹蟲草菌種液。在采摘山上柞樹上的柞蠶繭，破蠶后取出鮮活的柞蠶蛹，消毒體表后自然晾干，在無菌條件下將蛹蟲草菌液注入蠶蛹體，將感染蛹蟲草菌的蠶蛹置于容器中，如罐頭瓶等。仿生培養(yǎng)40～60天，控制溫度25℃左右，光照為1000～1500Lux，濕度為7

25、0～85%。待生出火紅色子實體并成熟后采收。</p><p>　　人工培育的蛹蟲草與野生的冬蟲夏草經(jīng)嚴格的測試，他們在功能與功效上并無區(qū)別，但其生產(chǎn)成本卻大大降低，一般工薪階層都能消費得起，這不能不說是對人類健康的一大重要貢獻。蛹蟲草菌絲體是冬蟲夏草的有效替代品，根據(jù)科學(xué)家們分析檢驗，它具有與冬蟲夏草相同的功效：入肺、腎、肝，具有補肺、強肝、益腎、補精、益氣的效果，且無毒副作用，不僅能提高人體免疫功能，還能抵抗疲

26、勞，分解肌肉中疲勞物質(zhì)，使人體耐疲勞度增加，提高機體的運動能力。</p><p>　　圖2-1 野生冬蟲夏草 圖2-2 蛹蟲草菌絲體</p><p><b>　　2.1.2 成分</b></p><p>　　蛹蟲草菌絲體即人工蟲草，功效成分主要是腺苷、3-脫氧腺苷（蟲草素）、蟲草多糖、麥角甾醇

27、以及D-甘露醇（蟲草酸）類物質(zhì)和一些維生素類，蛹蟲草菌絲體的主要活性成分明顯要高于冬蟲夏草。</p><p><b>　?。?）腺苷</b></p><p>　　不僅是蛹蟲草核苷酸的主要成分，而且是蛹蟲草的主要有效成分。可以直接轉(zhuǎn)化為蟲草素來發(fā)揮作用，其自身也能發(fā)揮防止心律失常，改善心腦血管循環(huán)，調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性和抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放等作用。</p>&

28、lt;p>　?。?）3-脫氧腺苷（蟲草素）</p><p>　　它是一種核苷類抗生素，具有有抑制腫瘤，抗菌，抗病毒，免疫調(diào)節(jié)的作用，由于其保護生命體遺傳密碼的特殊功效及修復(fù)細胞，已成為了抗癌藥物的新寵。其中治療白血病已進入2期臨床試驗。在美國，蟲草素類抗癌與抗病毒已進入了3期臨床試驗，蟲草素在天然蟲草中含量極少，每克純品價格高達四萬港幣（2007年），人工合成的已有資料報道，但尚無規(guī)?；a(chǎn)。</p&

29、gt;<p><b>　　（3）麥角甾醇</b></p><p>　　麥角甾醇是蛹蟲草中最主要的一種甾醇，也是蛹蟲草質(zhì)量控制的指標。麥角甾醇是一種重要的維生素D源，它具有抗癌，減毒，防衰等功效，在蛹蟲草菌絲體中的含量高于冬蟲夏草。</p><p><b>　?。?）蟲草多糖</b></p><p>　　蟲草屬

30、真菌的僵蟲體、子座、發(fā)酵液及菌絲體中均含有多糖，蛹蟲草多糖是一種高分子復(fù)合物，是蛹蟲草中含量最高的藥理活性物質(zhì)，其具有抗傳染病的功效，抗腫瘤，益精氣，補腎壯陽，防止衰老，延年益壽的作用，在蛹蟲草菌絲體中的含量高于冬蟲夏草。</p><p>　?。?）超氧化物歧化酶（SOD）</p><p>　　超氧化物歧化酶是一種非常重要的抗氧化酵素，是在人體內(nèi)自然生成的一種酶。它是保護身體細胞的一種物質(zhì)

31、，可以幫助體內(nèi)清除粒腺體過多產(chǎn)生的自由基，避免細胞受到氧化、老化或破壞。另外，張顯科等測出蛹蟲草含有超氧化物歧化酶(SOD)584 ug/mgpro[1]。</p><p><b>　?。?）氨基酸類</b></p><p>　　蛹蟲草富含十八種氨基酸，包括人體必須的氨基酸，其中蛹蟲草的賴氨酸、酪氨酸、異亮氨酸等含量相當于冬蟲夏草的一倍，說明蛹蟲草的蛋白質(zhì)質(zhì)量優(yōu)于冬蟲

32、夏草。姜泓等從人工蛹蟲草菌絲體中分離出蟲草環(huán)肽A[2]，具免疫和抗真菌作用。</p><p><b>　?。?）無機元素</b></p><p>　　蛹蟲草菌絲體中所含微量元素非常豐富，已檢出有37種元素，其中以P的含量最高，其次是Na,K,Mg,Mn,Fe,Cu,Zn。其中被稱為抗癌之王的硒，含量高達0.54ug/g，所以，蛹蟲草具有提高人體免疫的功效。</p

33、><p><b>　?。?）維生素類</b></p><p>　　每100g冬蟲夏草中含維生素A 29.19ug，維生素B 120.12ug,維生素C 116.03ug，每100g人工培養(yǎng)蛹蟲草菌絲體中含維生素B 120.27ug。張顯科等測出蛹蟲草菌絲體中含有多種及其重要的維生素，其中維生素B6和維生素E含量最高，維生素B1和維生素B12的含量也較高[1]。維生素A含量

34、是豬肝的13倍，維生素B2是人參的4038倍和豬肝的13倍，維生素C是香菇的8倍，維生素E的含量高于菇類。</p><p>　　表2-1 蛹蟲草與其它蟲草活性物質(zhì)比較</p><p>　　表2-2 腺苷酸含量比較（mg/100g）</p><p>　　表2-3 冬蟲夏草與蟲草菌絲體核苷類成分比較（mg/100g）</p><p>　　表

35、2-4 多糖及甘露醇含量（%）</p><p>　　表2-5 冬蟲夏草及蟲草菌絲體化學(xué)成分比較（mg/100g）</p><p>　　表2-6 冬蟲夏草及蟲草菌絲體無機元素比較（ug/g）</p><p>　　2.2 蛹蟲草菌絲體多糖</p><p>　　多糖是存在于自然界中的醛糖或酮糖，通過糖苷鍵連接在一起的多聚物。同時含有少量的氨基

36、酸、蛋白質(zhì)、微量元素和其他功能的側(cè)鏈基團,它是一切有生命的機體必不可少的成分,與維持生物機能密切相關(guān)[3]。近年來隨著多糖的分離、分析、制備以及結(jié)構(gòu)以及功能性研究的發(fā)展,研究者們對于多糖有了更加深入的了解,充分認識到了這類化合物在抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、治療疑難雜癥等方面的特殊功效,對這一新型藥物開發(fā)的非常重要的原料來源有了更充分的認識。蛹蟲草作為我國名貴的傳統(tǒng)中藥,是一種極具保健功能的藥用真菌,在《本草備要》（1694）中也有關(guān)于蛹蟲草的

37、論述。蛹蟲草菌絲體多糖在蛹蟲草中含量較高,而且生理作用非常廣泛。</p><p>　　2.2.1蛹蟲草菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)</p><p>　　蛹蟲草菌絲體多糖，分子量為27kD，是一種含有少量蛋白的半乳甘露糖CM-1。單糖組成的摩爾比為半乳糖：甘露糖=6:5，蛹蟲草菌絲體多糖具有高度分枝結(jié)構(gòu),以-（1→2）連接的甘露糖為主干,支鏈由較大量的-（1→6）吠喃半乳糖組成,分別連接在主干O-4和

38、O-6上，消除反應(yīng)與氨基酸分析表明：CM-1的糖鏈和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合是通過蘇氨酸和絲氨酸的O-糖昔鍵連接而成的[4]。</p><p>　　蟲草多糖(CMPS)是蛹蟲草中的非常重要的活性物質(zhì)，國內(nèi)外研究人員對蛹蟲草多糖結(jié)構(gòu)的研究較多，而不同研究人員測得蟲草多糖的結(jié)構(gòu)略有差異。</p><p>　　藏藥研究中報道：從蛹蟲草菌絲體中分離出兩種多糖：一種由分子量約為23kD組成的D-半乳糖和D-

39、甘露糖，其分子比為5：3。另一種是由分子量約為43kD單糖組成的葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，比例為1：3.6：10.3。</p><p>　　李曉明[5]對冬蟲夏草菌種發(fā)酵濾液中多糖的研究結(jié)果表明,蟲草菌濾液中的多糖由半乳糖、木糖和葡萄糖、甘露糖組成。</p><p>　　鄧嵐等[6]在固體發(fā)酵的蟲草菌擬青霉中分離提純得到的糖含量為56%的蟲草菌多糖,經(jīng)薄層層析與氣相色譜分析組成單糖比分別為

40、:阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、半乳糖,物質(zhì)的量的比為1∶1∶2∶3∶3,這與有關(guān)文獻報道的有所差異。經(jīng) Sephadex G-75凝膠柱分離純化得到的糖含量為72%，用Sepharose 4B凝膠柱測定的分子量分別為57000和40000。</p><p>　　陳安平[7]從亞香棒蟲草中也分離出了一種水溶性多糖,組分分析后得其單糖比為葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖=0.1∶0.47∶1。</p><

41、;p>　　2.2.2蛹蟲草菌絲體多糖的特點</p><p>　　蛹蟲草菌絲體及其胞外多糖具有良好的觸變性、增稠性、抗鹽耐熱性和對pH的穩(wěn)定性。蛹蟲草菌絲體及其胞外多糖還具有一定的抗氧化活性,如在60℃促進氧化條件下放置7天,則0.05%含量的菌絲體及其胞外多糖油脂氧化率分別降低為18.8%和19.8%[8]。</p><p>　　藥理學(xué)研究表明，蛹蟲草多糖對網(wǎng)狀皮系統(tǒng)及巨噬細胞有明顯

42、的激活作用，能促進淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，是一種非特異性免疫增強及調(diào)節(jié)劑，可激活機體的免疫活性細胞，特別是淋巴細胞及其淋巴因子、單核巨噬細胞系統(tǒng)和NK細胞等，從而攻擊靶細胞，發(fā)揮抗腫瘤的作用[9-10]。</p><p>　　迄今為止，人們對蛹蟲草多糖的研究還寥寥無幾,只是近幾年蛹蟲草的人工培養(yǎng)及其活性成分研究才相對活躍起來。實驗表明：蛹蟲草多糖作為蛹蟲草的活性成分之一，對小鼠的特異性及非特異性體液免疫和紅細胞免疫都有顯

43、著的增強作用。它作為免疫促進劑的同時,也可作為抗癌作用發(fā)揮的有效物質(zhì)。通過免疫調(diào)節(jié)，蛹蟲草多糖達到治療和控制腫瘤的目的。另外，蛹蟲草多糖還有促進SOD酶活力的作用，它對延緩衰老也有顯著意義。因此，為了更進一步研究蛹蟲草多糖活性，加速其臨床應(yīng)用進程,有必要對其最適宜的分離條件進行深入的研究[11]。</p><p>　　蛹蟲草菌絲體多糖可以活化巨噬細胞、刺激抗體的產(chǎn)生,提高人體的免疫能力,其抗腫瘤活性也漸漸被人們公

44、認[12]。多糖有抗炎作用，且持續(xù)性明顯，其發(fā)酵液中還有抗菌活性物質(zhì)，對馬鈴薯芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等均有明顯抑制作用，在研制新型保鮮劑和殺菌劑方面有良好應(yīng)用前景[13]。</p><p>　　2.2.3 蛹蟲草菌絲體多糖的功效</p><p>　　2.2.3.1抗氧化、抗衰老作用</p><p>　　經(jīng)研究證實，蛹蟲草菌絲體多糖能促進SOD酶活力，具有顯著的抗衰

45、老作用，對老年性癡呆的有效率明顯優(yōu)于維生素E。同時能提高老齡鼠GSHPX(谷胱甘肽過氧化物酶)、活性SOD和明顯降低體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物含量。因此，蛹蟲草菌絲體多糖是通過抗氧化作用實現(xiàn)的抗衰老作用。</p><p>　　2.2.3.2調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)作用</p><p>　　蛹蟲草的免疫作用主要是蛹蟲草菌絲體多糖在發(fā)揮其效應(yīng)，研究表明，蛹蟲草菌絲體多糖的不同組分都能增加小鼠的脾臟和胸腺的重量，提

46、高機體的細胞免疫與體液免疫。蛹蟲草菌絲體的胞內(nèi)及胞外多糖均明顯著提高小鼠腹腔內(nèi)巨噬細胞吞噬指數(shù)和吞噬率，其吞噬功能的增強表明機體非特異性免疫的增強。另外，蛹蟲草菌絲體多糖還能明顯增強小鼠血清溶菌酶的活力，促進紅細胞C3b降低，提高小鼠的肝紅細胞SOD酶活力。蛹蟲草菌絲體多糖對周血淋巴細胞有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。</p><p>　　徐廷萬等[14]對人工蛹蟲草菌絲體胞外多糖對抗疲勞作用及受抑制的免疫功能的影響進行了研

47、究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人工蛹蟲草菌絲體胞外多糖可增強免疫功能、被抑制的非特異性免疫功能和體液免疫功能，同時人工蛹蟲草菌絲體胞外多糖還能顯著地延長負重小鼠的游泳時間，即具有抗疲勞作用。</p><p>　　俞麗露等[15]研究了蛹蟲草菌絲體多糖不同組分對小鼠免疫功能的影響，結(jié)果表明，蛹蟲草菌絲體多糖不同組分對單核巨噬細胞的吞噬能力均有較顯著增強作用，并且可以明顯地增加經(jīng)地塞米松免疫抑制作用后胸腺和脾臟的重量，提高臟器指數(shù)。

48、</p><p>　　2.2.3.3抗炎作用</p><p>　　炎癥早期表現(xiàn)為毛細血管通透性增大而引起腫脹和炎癥滲出等反應(yīng)，是機體的活組織對損傷因子所發(fā)出的防御反應(yīng)，蛹蟲草菌絲體多糖對醋酸所致毛細血管通透性的增高和巴豆油所致耳腫脹等均有顯著抑制作用，表明其具有良好的抗炎作用。主要原因是蛹蟲草菌絲體多糖，尤其是菌藻類多糖能夠調(diào)節(jié)免疫細胞間信息的感受與傳遞，細胞的轉(zhuǎn)化、分裂和再生等活動，具有

49、顯著地抗炎作用。</p><p>　　賓文等[16]對人工培養(yǎng)蛹蟲草菌絲體多糖抗炎和免疫作用的研究中發(fā)現(xiàn):蛹蟲草菌絲體多糖對小鼠耳腫脹與毛細血管通透性增高等均有抑制作用，抑制小鼠溶血素的生成，對免疫器官重量、DTH等免疫作用、碳粒廓清功能無明顯影響。</p><p>　　2.2.3.4抗腫瘤作用</p><p>　　多糖類的物質(zhì)是蛹蟲草菌絲體主要活性物質(zhì)之一，近來的

50、研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌絲體多糖對網(wǎng)狀皮系統(tǒng)及巨噬細胞有明顯的激活作用，能夠促進淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)及增強劑，可以激活機體的免疫活性細胞，特別是單核巨噬細胞系統(tǒng)、淋巴因子及淋巴細胞、NK細胞等，從而攻擊靶細胞，發(fā)揮抗腫瘤的作用。主要原因是蛹蟲草菌絲體多糖能夠促進免疫細胞增殖、分泌，增強免疫細胞的功能，通過宿主介導(dǎo)從而發(fā)揮抗腫瘤作用。蛹蟲草菌絲體多糖抑制腫瘤的機理已經(jīng)取得初步進展。2004年研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草發(fā)酵菌絲提取物通過影響

51、相關(guān)的基因表達來抑制血管的形成，從而抑制黑色素瘤生長。2005年研究表明，蛹蟲草水提液能通過誘導(dǎo)細胞凋亡從而使白血病細胞U937的生長受到抑制，最終可以抑制腫瘤細胞的生長。</p><p>　　湯新強等[17]研究人工蛹蟲草菌絲體胞外多糖對毒性劑量卡鉑骨髓抑制作用的影響以及對治療劑量卡鉑抗小鼠的實驗性腫瘤作用的影響。發(fā)現(xiàn)人工蛹蟲草菌絲體胞外多糖與治療劑量的卡鉑合用，可以增強卡鉑的抗腫瘤作用；人工蛹蟲草菌絲體胞外多

52、糖與毒性劑量的卡鉑合用，可以對抗卡鉑引起的血小板減少，其對增強抗自由基引起的脂質(zhì)過氧化性損傷，抗機制與減輕卡鉑抑制骨髓造血細胞的GSH-PX活性有關(guān)。</p><p>　　2.2.3.4降血糖作用</p><p>　　人工蛹蟲草菌絲經(jīng)熱水浸提，乙醇沉淀等處理后得到多糖精品。若口服劑量在500mg/kg的多糖精品時，對正常的小鼠沒有明顯的降血糖作用；若腹腔給予劑量在100mg/kg和50mg

53、/6g的多糖精品時，對正常的小鼠、四氧嘧啶糖尿病模型的小鼠和鏈尿佐菌素糖尿病模型的小鼠均有明顯的降血糖作用。正常小鼠血糖水平最多甚至可以降到60%左右，而糖尿病模型小鼠最多可以降到約40%，精多糖對高血糖小鼠的作用要強于正常小鼠，而且高劑量組下降的幅度要大于低劑量組，而且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。</p><p>　　季暉等[18]對人工蛹蟲草菌絲多糖生理功能的研究中發(fā)現(xiàn),蛹蟲草多糖(CP)對正常小鼠與四氧嘧啶糖尿病和

54、鏈脲佐菌素糖尿病模型小鼠均有顯著的降血糖作用,而且有一定量效關(guān)系。</p><p>　　姚思宇等[19]在蛹蟲草菌絲體多糖降血脂作用的動物試驗研究中發(fā)現(xiàn)，3個蟲草多糖試驗組的TC和TG于30d的含量明顯低于高脂對照組；而HDlLC含量明顯高于高脂對照組，說明人工培育的蝙蝠蛾擬青霉蟲草多糖有降血脂效果。</p><p>　　另有研究報道,蛹蟲草菌絲體多糖可降低血液中三油甘酯和膽固醇的含量。蛹

55、蟲草菌絲體多糖具抗腫瘤、抗輻射、誘生干擾素等作用也相繼報道[20,21]。</p><p>　　2.2.4 蛹蟲草菌絲體多糖的應(yīng)用</p><p>　　2.2.4.1保健食品</p><p>　　保健食品方面，蛹蟲草菌絲體多糖的應(yīng)用也非常之廣。研究者們以營養(yǎng)性食品凝膠劑和功能性甜味劑為載體，引入蛹蟲草的提取液，經(jīng)過合理的制作工藝，制成低熱量、具有保健功能的蛹蟲草高級

56、果凍和新型蛹蟲草保健軟糖。</p><p>　　2.2.4.2醫(yī)藥制劑</p><p>　　依據(jù)蛹蟲草菌絲體多糖的藥理作用，研究者們正在進一步研究并挖掘它在保健食品、醫(yī)藥等各方面的價值。由于蛹蟲草多糖具有增強機體免疫力、抗腫瘤作用、治療肝的病毒性感染、抗免疫損害性大鼠肝纖維化作用和降血糖等多方面藥理作用，蛹蟲草菌絲體多糖被提取并制成各種醫(yī)療藥劑。</p><p>&

57、lt;b>　　2.2.4.3其它</b></p><p>　　蛹蟲草菌絲體多糖甚至對艾滋病毒有直接的抑制作用，并且有望成為阻止艾滋病毒攜帶者表現(xiàn)癥狀的藥物。此外蛹蟲草菌絲體多糖在日用化妝品方面，在食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)及石油工業(yè)等行業(yè)上也有著廣泛的應(yīng)用［22～24］。</p><p>　　2.3 蛹蟲草菌絲體多糖提取方法</p><p>　　2.3.1

58、一般提取法</p><p>　　蛹蟲草菌絲體多糖的提取一般是采用水煮醇沉的方法。通常先用乙醚脫脂，再熱水提取、乙醇沉淀而得到粗多糖。由于不同研究者用的提取方法不同，所以菌絲體粗多糖得率也不同。</p><p>　　季暉等[25]取人工蛹蟲草菌絲體干粉200g，經(jīng)過10g甲醇、7g乙醇索氏提取后，殘渣用熱水反復(fù)提取5次，提取液對自來水透析2天后再對無離子水透析2天，合并未經(jīng)透析的部分，稍加濃

59、縮后，再加入兩倍體積的乙醇，再離心收集乙醇沉淀，將沉淀物用水洗滌濃縮后真空干燥即得粗多糖，產(chǎn)率為6.67％。</p><p>　　馬成堅等[26]取蛹蟲草的膠囊粉末100g，置于索氏提取器中，在圓底燒瓶中加入無水乙醚l00mL，連續(xù)回流提取直至無色。藥渣風(fēng)干后用八倍量的沸水回流提取2次，每次30min，趁熱過濾，并將濾液濃縮至15mL后，再加乙醇至含醇量為80％，在冰箱中靜置過夜后離心過濾，并加入0.2％的活性炭

60、脫色。將沉淀分別用無水乙醇、丙醇依次洗滌3次，每次5mL，置60℃烘干后得到灰白色粗多糖，得率為4.9％。</p><p>　　姚桂卿等[27]取無雜菌蛹蟲草發(fā)酵物壓濾后，將菌絲體和發(fā)酵液分開，菌絲體加五倍體積水，于90～95℃浸煮10h，浸煮4次，再浸煮液抽濾，濾液減壓濃縮至一定體積后離心棄去濾渣，于上清液中加三倍體積的95％乙醇沉淀過夜，離心后收集沉淀，加入丙酮和乙醚反復(fù)洗滌，然后置真空干燥器中真空干燥，得粗

61、多糖黃色粉末，得率為2.8％。</p><p>　　2.3.2 超聲波提取法</p><p>　　超聲波提取多糖是基于超聲波的特殊物理性質(zhì)。主要是主要通過壓電換能器產(chǎn)生的快速機械振動波來減少目標萃取物與樣品基體之間的作用力從而實現(xiàn)固液萃取分離。超聲波提取法的原理[28]是：</p><p>　　（1）加速介質(zhì)質(zhì)點運動。根據(jù)惠更斯波動原理，在高于20 KHz聲波頻率的

62、超聲波的連續(xù)介質(zhì)中（比如水）傳播時，在其波陣面上將引起介質(zhì)質(zhì)點（包括菌絲體重要有效成分的質(zhì)點）的運動，從而使介質(zhì)質(zhì)點運動獲行巨大的動能和加速度。質(zhì)點的加速度經(jīng)計算甚至可達重力加速度的2000倍以上。由于介質(zhì)質(zhì)點將超聲波能量作用于菌絲體有效成分質(zhì)點上而使其獲得巨大的加速度和動能，迅速逸出菌絲體而游離于水中。</p><p>　?。?）空化作用。超聲波在液體介質(zhì)中傳播會產(chǎn)生特殊的“空化效應(yīng)”，使其不斷產(chǎn)生內(nèi)部壓力甚至

63、達到上千個大氣壓的微氣穴且不斷“爆破”產(chǎn)生微觀上的強大沖擊波作用在菌絲體上，使其中菌絲體有效成分物質(zhì)被“轟擊”逸出，并使得菌絲體被不斷剝蝕，加速多糖等有效成份的浸出提取。</p><p>　?。?）超聲波的振動均勻化可使樣品介質(zhì)內(nèi)各點受到的作用一致，使整個樣品提取更加均勻。</p><p>　　顏輝等[29]利用超聲波法輔助提取蛹蟲草菌絲體多糖，結(jié)果顯示，對提取率影響由大到小依次為料液比，

64、超聲波功率，提取溫度，提取時間，最佳工藝參數(shù)是料液比1:45，溫度為80℃，超聲波功率為140W，提取時間為80min，多糖提取得率是3.98%，工藝穩(wěn)定可靠。</p><p>　　2.3.3 微波提取法</p><p>　?。?）微波所產(chǎn)生的電磁場加速被萃取部分成分向萃取溶劑界面擴散速率。用水做溶劑時，在微波場下，水分子高速轉(zhuǎn)動成為激發(fā)態(tài)，這是一種高能量不穩(wěn)定狀態(tài)，或水分子汽化加速萃取組

65、分的驅(qū)動力?；蛘咚肿颖旧磲尫拍芰炕氐郊B(tài)，所釋放能量傳遞給其它物質(zhì)分子，加速其熱運動，縮短萃取組分的分子由物料內(nèi)部擴散到萃取溶劑界面的時間，從而使萃取速率提高數(shù)倍，同時還降低了萃取溫度，最大限度的保證了萃取質(zhì)量。</p><p>　?。?）微波輻射過程是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)，到達物料的內(nèi)部維管束和腺胞系統(tǒng)。由于吸收了微波能量，細胞內(nèi)部溫度迅速上升，使其細胞內(nèi)部壓力超過細胞壁的膨脹承受能力，細胞破裂。細胞內(nèi)有效

66、成分自由流出在較低的溫度下萃取介質(zhì)捕獲并溶解。通過進一步過濾和分離便獲得了萃取物料。</p><p>　　白霞等[30]以微波輔助法提取蛹蟲草菌絲體中的多糖，取粉碎后蛹蟲草干粉樣品1.0g加入到40mL去離子水中，選擇微波功率低火，提取14min，多糖提取量最高為3.93%。 </p><p>　　施英等[31]有效利用微波輔助法從蛹蟲草菌絲體中提取多糖，并采用單因素和正交實驗進行最佳條件

67、的優(yōu)化研究，結(jié)果表明，在微波功率為80%、料液比1:20的條件下提取20min，蛹蟲草菌絲體粗多糖的提取率為10.97%。</p><p>　　2.3.4 熱回流提取法</p><p>　　熱回流提取法是以甲醇、乙醇等易揮發(fā)的有機溶劑為提取溶劑，對浸出液加熱蒸餾，揮發(fā)性溶劑餾出后經(jīng)冷凝后重新回到浸出器中繼續(xù)浸提，并循環(huán)進行，直至有效成分完全浸提。熱回流法是將樣品放入冷凝系統(tǒng)的浸取器內(nèi)，然后

68、用溶劑浸沒樣品的表面，浸泡一定時間后再加熱浸提，蒸發(fā)的溶劑經(jīng)冷凝后直接回流到浸取器內(nèi)，規(guī)定時間后可將回流液濾出，再添加新溶劑繼續(xù)回流數(shù)次，合并各次回流的浸出液，再餾出溶劑，即可得浸出的濃縮液待用。</p><p>　　2.3.5 分級沉淀法</p><p>　　不同的多糖在不同濃度的甲醇、乙醇和丙酮中的溶解度不同，因此，可在不同濃度的有機溶劑中分級沉淀分子大小不同的黏多糖。在Zn2+、Ca

69、2+等二價金屬離子的存在下，采用乙醇分級分離黏多糖可以獲得最佳分離效果。</p><p>　　2.3.6 超濾膜分離法</p><p>　　超濾是一種膜分離技術(shù)，所采用的超濾膜能夠從水和其他液體中分離出很小的膠體和大分子。由于超濾膜擁有不對稱微孔結(jié)構(gòu)，且采用摩擦流道和湍流促進結(jié)構(gòu)，減少膜污染，使得在分離過程中大分子溶質(zhì)和微粒（例如淀粉、膠體等）隨溶液切向流經(jīng)膜表面，而小分子物質(zhì)和溶劑則在壓

70、力驅(qū)動力下穿過致密層上的微孔而進入膜另一側(cè)，因而超濾膜可以長期連續(xù)使用并保持較恒定的產(chǎn)量和分離效果。將超濾膜用于多糖這種生物活性物質(zhì)的分離，具有不損害活性，分離效率高，能耗低，設(shè)備簡單，可連續(xù)性生產(chǎn)，無污染等優(yōu)點。</p><p><b>　　2.3.7 色譜法</b></p><p>　　按色譜法分離所依據(jù)的物理化學(xué)性質(zhì)不同，可將其分為：</p>&l

71、t;p><b>　?。?）吸附色譜法</b></p><p>　　此法是利用吸附劑表面對不同組分物理吸附性能的不同而使之分離的色譜法。其適于分離不同種類的化合物（如芳香烴與分離醇類）。</p><p>　?。?）離子交換色譜法</p><p>　　利用液相色譜技術(shù)和離子交換原理的結(jié)合來測定溶液中陰離子和陽離子的一種分離分析方法。利用固定相

72、與被分離組分之間發(fā)生離子交換的能力不同來實現(xiàn)分離。此法主要是用來分離可離解的化合物或離子。它不僅廣泛應(yīng)用于無機離子的分離，而且廣泛在有機和生物物質(zhì)，例如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等的分離。</p><p><b>　　（3）分配色譜法</b></p><p>　　利用固定液對不同組分的分配性能差別而使之分離。</p><p><b>　?。?/p>

73、4）親和色譜法</b></p><p>　　具有高度親和性的兩種物質(zhì)之一作為固定相，由于與固定相有不同程度的親和性，而使成分與雜質(zhì)分離的色譜法。例如，利用基質(zhì)與酶、抗原與抗體，激素與受體等之間專一的相互作用，使物質(zhì)之一與不溶性擔(dān)體形成共價的結(jié)合化合物，作為層析用固定相，將另一方從混合物中選擇可逆地截獲，達到提純的目的?？捎糜诜蛛x活體高分子的物質(zhì)及細胞。</p><p>　?。?

74、）尺寸排阻色譜法</p><p>　　按分子大小的順序進行分離的一種色譜方法。體積大的分子不能滲透過凝膠孔穴中而被排阻，較早的淋洗出來，中等體積的分子部分滲透，小分子則可完全滲透到內(nèi)部，最后洗出色譜柱。因此，樣品分子基本按其分子的大小先后排阻，從柱中流出。被廣泛用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。</p><p>　　2.3.8 季銨鹽絡(luò)合法</p><p>　　

75、多糖與一些陽離子的表面活性劑如十六烷基氯化吡啶（CPC）和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等形成季銨鹽絡(luò)合物，這些絡(luò)合物在低離子強的水溶液中是不溶解的，在離子強度大時，這些絡(luò)合物可以解離、溶解并釋放。使其溶解度發(fā)生明顯改變的無機鹽濃度（臨界鹽濃度）主要由聚陰離子的電荷密度決定。</p><p>　　2.3.9 酸堿提取法</p><p>　　有些多糖適合用稀酸提取，且能夠得到更高的提取率。

76、將熱水浸提過的含多糖物質(zhì)加8倍量3%的三氯乙酸浸提，15℃過夜后過濾，離心，再將提取液用20%的NaOH中和至pH為7，濃縮后醇析沉淀、丙酮洗滌、真空冷凍干燥后得酸提水溶性粗多糖。</p><p>　　與酸提取法類似，有些多糖在堿中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖和酸性多糖。采用稀堿提取：多為0.1mol/L氫氧化鉀、氫氧化鈉，為了防止多糖降解，常通以氮氣或加入硼氫化鈉硼及氫化鉀。</p>

77、<p>　　2.4 蛹蟲草菌絲體多糖的測定方法</p><p>　　2.4.1 氣相色譜法</p><p>　　糖類分子間引力一般較強，揮發(fā)性弱，故不能直接進行氣象色譜分析。把糖制成某種具有揮發(fā)性的衍生物，就可用氣相色譜法進行分離分析，所用衍生物有三氯硅烷（TMS）衍生物、三氟乙酸（TFA）衍生物、乙酰衍生物和甲基衍生物等，其中常用的是前兩種。</p><p

78、>　　樣品處理后，使之生成揮發(fā)性TMS衍生物后注入色譜儀器，在一定色譜條件下得出色譜圖，再與標準樣品的色譜圖進行比較，根據(jù)峰的保留時間定性，根據(jù)峰面積，內(nèi)標法定量。</p><p>　　2.4.2 高效液相色譜法</p><p>　　高效液相色譜(HPLC)是分離與鑒定多糖的一種非常實用而且精細的設(shè)備。樣品經(jīng)適當前處理后，將糖類水溶液注入反相化學(xué)鍵合相色譜體系，用乙腈和水為流動相，糖

79、類分子按其分子質(zhì)量有小到大的順序流出，經(jīng)差示折光檢測器檢測，與標準比較定量。根據(jù)待定糖的種類，通過改變流動相乙腈溶液的濃度，可以擴大使用范圍。</p><p>　　2.4.3 苯酚-硫酸法</p><p>　　苯酚硫酸試劑可與游離的寡糖或多糖被濃硫酸在適當高溫下水解，產(chǎn)生單糖，并迅速脫水成糠醛衍生物，該衍生物在強酸條件下與苯酚起顯色反應(yīng)，生成橙黃色物質(zhì)，在波長490nm處（戊糖及糖醛酸在4

80、80nm處）有最大吸收，吸收值與含量成線性關(guān)系，從而可用比色法測其含量。</p><p>　　2.4.4 離子色譜法</p><p>　　糖是一種多羥基醛或酮的化合物，具有弱酸性，當PH為12-14時會發(fā)生解離，所以能被陰離子交換樹脂（HPAC）保留，用PH》12的氫氧化鈉溶液淋洗，可實現(xiàn)糖的分離，再以脈沖安培檢測器（PAD）檢測，以峰保留時間定性。以峰外標法定量。本法靈敏度高（檢測下限可

81、達ng/mL級）、選擇性好、操作簡單、樣品不必進行復(fù)雜的前處理等優(yōu)點。</p><p>　　2.4.5 蒽酮比色法</p><p>　　糖與硫酸反應(yīng)，脫水生成羥甲基呋喃甲醛，再與蒽酮縮合成藍色配合物。其顏色與糖濃度成正比。單糖、雙糖、糊精、淀粉等均與蒽酮反應(yīng)。因此，如測定不需要包括糊精、淀粉等糖類時，需將他們除去后測定。本法在20～200mL/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。</p

82、><p>　　2.5 國內(nèi)外研究的現(xiàn)狀</p><p>　　我國和日本對蛹蟲草菌絲體多糖研究的最多,蛹蟲草菌絲體多糖脂質(zhì)體和蛹蟲草菌絲體多糖的藥理功能逐漸被醫(yī)學(xué)界認可。冬蟲夏草在我國中醫(yī)藥史上已經(jīng)應(yīng)用了幾百年，幾乎家喻戶曉。而蛹蟲草發(fā)現(xiàn)較晚，最早在1958年吉林省長白山區(qū)被發(fā)現(xiàn)，吉林省蠶業(yè)研究院科技人員于1987年8月在九臺土門嶺山林采集了新鮮野生蛹蟲草，開始人工培育并成功，目前，知道蛹蟲草真

83、實身份、功效的人極少，加之在2009年前國家規(guī)定有空白，蛹蟲草既不是食品也沒有進藥典，所以應(yīng)用無依據(jù)。加之研究深度不夠，推廣力度不大，所知道其功能性、重要性和應(yīng)用可能性的人較少是自然的。</p><p>　　但是，蛹蟲草是冬蟲夏草的優(yōu)秀人工版，其性價比優(yōu)于冬蟲夏草的觀點必將被人們共識，蛹蟲草菌絲體多糖作為蛹蟲草中含量最高的生物活性物質(zhì),引起了人們極大的興趣和廣泛的關(guān)注。我國科學(xué)工作者自20世紀七八十年代開始對蛹蟲

84、草多糖的深層發(fā)酵技術(shù)、生理活性研究進行研究。利用蛹蟲草菌絲體生產(chǎn)出的保健品也陸續(xù)上市,它以全面提高人體免疫力,抗癌,抗衰老等生理功能而倍受消費者歡迎。目前，人們對于蛹蟲草的研究已經(jīng)從最簡單的發(fā)酵培養(yǎng)得到菌絲體，進入到了對其成分的分子水平、甚至基因水平的研究和應(yīng)用開發(fā)方面。對于蛹蟲草菌絲體多糖，在通過大規(guī)模發(fā)酵得到蛹蟲草菌絲體后，對于多糖的提取就成為了進一步研究和應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。</p><p>　　在糖類的研究方

85、面，日、美、歐三國投入了很大的精力。日本于1989年創(chuàng)辦了《糖科學(xué)與糖工程動態(tài)》雜志，1991年開始實施一項為期15年，投資數(shù)百億日元的“糖工程前沿計劃”，并且推出有關(guān)“糖工程基礎(chǔ)與應(yīng)用研究推動戰(zhàn)略”的咨詢。美國能源部于1986年資助佐治亞大學(xué)創(chuàng)建了復(fù)合糖類研究中心，建立復(fù)合糖類數(shù)據(jù)庫，到1900年已收集到了42000個糖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。歐盟于1994～1998年啟動“歐洲糖類研究開發(fā)網(wǎng)絡(luò)”計劃，其旨在攜帶歐洲各國的糖類研究。</p&g

86、t;<p>　　目前，對于蛹蟲草菌絲體多糖的藥理作用研究日益增多，但對其作用的機制研究卻并不完善，對于多糖作用的靶細胞、及靶系統(tǒng)發(fā)揮多種藥理作用的微觀機理還不明確。菌絲體多糖與其活性片段及寡糖結(jié)構(gòu)，藥理活性之間的關(guān)系，菌絲體多糖發(fā)揮藥理作用的活性形式等許多問題還有待進一步研究。</p><p>　　2.6 本論文的研究內(nèi)容及研究意義</p><p>　　蛹蟲草作為我國名貴且傳

87、統(tǒng)的強壯滋補品，在歷史上很早就引起了重視和應(yīng)用。近年來由于國家的重視和商業(yè)經(jīng)濟的需求，對蛹蟲草的生產(chǎn)、研究和應(yīng)用取得了迅速發(fā)展。蛹蟲草多糖作為蛹蟲草中含量最高的生理活性物質(zhì)，也是其最主要活性成分之一。所以，隨著對蛹蟲草多糖研究的不斷深入，利用蛹蟲草多糖開發(fā)的保健品，功能性食品添加劑和藥品的市場前景為人研究者們所看好。為了研究出有利于人們身體健康的、經(jīng)濟效益高的蛹蟲草多糖類的深加工產(chǎn)品，就需要我們廣大的食品科學(xué)家、生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家們的共同

88、努力，從而帶動整個多糖研究的快速發(fā)展。</p><p>　　實驗就蛹蟲草菌絲體中多糖的提取進行了進一步的研究,不僅以多糖的提取為目標,還考慮到后續(xù)的處理方面,在盡可能多的提取出蛹蟲草菌絲體多糖的基礎(chǔ)上,通過提取方法的優(yōu)化,在提取過程中完成了對多糖的初級提取分離操作。本實驗為以后進一步研究蛹蟲草菌絲體多糖結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)，也進一步開發(fā)蛹蟲草菌絲體多糖產(chǎn)品提供了理論依據(jù)以及廣闊的市場經(jīng)濟前景，其實驗數(shù)據(jù)及實驗方法也為其他

89、領(lǐng)域的研究提供了平臺和參考。</p><p><b>　　第三章 試驗部分</b></p><p><b>　　3.1 材料與設(shè)備</b></p><p><b>　　3.1.1 原材料</b></p><p>　　蛹蟲草菌種，本院實驗室培養(yǎng)為菌絲體，選取質(zhì)地優(yōu)良的干品或鮮品

90、。</p><p>　　3.1.2 主要儀器</p><p>　?。?）YJ1002型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司； </p><p>　　（2）FQ—250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；</p><p>　　（3）FSH—Ⅱ型高速電動勻漿機，江蘇省金壇市金城國際實驗儀器廠；</p><p>

91、　　（4）721紫外可見分光光度計，上海亞容生化儀器廠；</p><p>　　（5）DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；</p><p>　?。?）G8023CTL—K3名秀光波微波爐，佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；</p><p>　　（7）SHZ—ⅢA循環(huán)水式真空泵，鞏義市金峪予華儀器廠；</p><p>　

92、?。?）101A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，中國天津泰斯特儀器有限公司；</p><p>　　（9）DH6—914385—Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；</p><p>　?。?0）RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；</p><p>　　（11）YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；</p>

93、<p>　　（12）HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠。</p><p>　　3.1.3 主要試劑</p><p>　?。?）乙醇(分析純)，北京化工廠；</p><p>　　（2）濃硫酸（分析純），沈陽市試劑五廠；</p><p>　　（3）苯酚（分析純），沈陽市試劑五廠；</p><p&g

94、t;　?。?）葡糖糖(分析純），北京化工廠；</p><p>　?。?）KH2PO4（分析純），北京化工廠；</p><p>　?。?）MgSO4（分析純），天津津北精細化工有限公司；</p><p>　　(7) NaOH （分析純），北京化工廠；</p><p>　?。?）蛋白胨（分析純），北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；</p>

95、;<p>　?。?）VB1（分析純），上?；菔郎噭┯邢薰?。</p><p><b>　　3.2 試驗方法</b></p><p>　　3.2.1蛹蟲草菌絲體的培養(yǎng)</p><p><b>　?。?）配制培養(yǎng)基</b></p><p>　　按照適宜的比例分別加入20g/L葡糖糖，1

96、0g/L蛋白胨，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4，50mg/L VB1于1000mL燒杯中，加入適量的蒸餾水，在電爐上加熱至沸騰后調(diào)整pH為5.8。</p><p><b>　?。?）滅菌</b></p><p>　　將配置好的液體培養(yǎng)基按照適宜的比例分別倒入250mL的錐形瓶中，編號，封口后放入高溫蒸汽滅菌鍋中滅菌，在壓力為0.1Mpa、溫度為121

97、℃下滅菌30min后取出。</p><p><b>　　（3）接菌</b></p><p>　　接種前20min，打開超干凈工作臺上的風(fēng)機以及臺上的紫外線燈，然后在無菌條件下接種蛹蟲草菌絲體的菌種。</p><p><b>　?。?）培養(yǎng)</b></p><p>　　將接種好的錐形瓶放入全溫振蕩培養(yǎng)

98、箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)8天。（第4d要進行擴大培養(yǎng)，以利于蛹蟲草菌絲體良好生長）</p><p><b>　?。?）抽濾</b></p><p>　　將擴大培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲體抽濾（濾液棄去），即得蛹蟲草菌絲體，放入塑料瓶中，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　3.2.2蛹蟲草菌絲體的預(yù)處理</p><p>　　準確稱取蛹蟲草

99、菌絲體50.0g于四個培養(yǎng)皿中，編號。平鋪以利于烘干，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中數(shù)天，直至烘干（45℃），再測其干重，結(jié)果如下表：</p><p>　　表3-1 蛹蟲草菌絲體干濕重比較</p><p>　　由烘干后的質(zhì)量知，濕重為干重的10倍。</p><p>　　3.2.3蛹蟲草菌絲體多糖的提取工藝</p><p><b>　　原料

100、</b></p><p><b>　　稱重</b></p><p>　　勻漿破壁（12000r/min）</p><p><b>　　加入蒸餾水</b></p><p><b>　　提取多糖</b></p><p>　　超聲波助提法

101、 熱水浸提法 微波助提法</p><p><b>　　抽濾</b></p><p>　　濾液 濾渣反復(fù)抽提</p><p><b>　　加入乙醇</b></p><p><b>　　醇沉24小時</b></p>&

102、lt;p><b>　　抽濾</b></p><p><b>　　粗多糖</b></p><p>　　圖3-1 蛹蟲草菌絲體多糖提取工藝</p><p><b>　　操作要點：</b></p><p>　?。?）由于采用醇沉法，考慮到有機溶劑易揮發(fā)，故實驗過程中要用保鮮膜將

103、錐形瓶瓶口密封。</p><p>　　（2）用保鮮膜將燒杯的口封嚴的同時，要保證超聲波清洗器的水位高于燒杯中的溶液部分；</p><p>　?。?）勻漿時每次倒適量于小錐形瓶中，以方便最后由足夠蒸餾水清洗錐形瓶；</p><p>　?。?）每次勻漿破壁要完全以達到提取最佳效果，勻漿機1.2萬轉(zhuǎn)/min，持續(xù)5min。</p><p>　　3.

104、2.4蛹蟲草菌絲體多糖提取方法的比較</p><p>　　3.2.4.1熱水浸提法</p><p>　　按上述提取工藝，準確稱取蛹蟲草菌絲體10.0g（即干重1.0g），加入100mL蒸餾水，熱水浸提3h，提取溫度80℃，乙醇濃度為90%，提取3次。</p><p>　　3.2.4.2超聲波法</p><p>　　按上述提取工藝，準確稱取蛹蟲

105、草菌絲體10.0g（即干重1.0g），加入100mL蒸餾水，超聲波功率為100W，溫度為60℃，時間為1h，乙醇濃度為90%，提取3次。</p><p>　　3.2.4.3微波法</p><p>　　按上述提取工藝，準確稱取蛹蟲草菌絲體10.0g（即干重1.0g），加入100mL蒸餾水，微波功率為100W，時間為10min，乙醇濃度為90%，提取3次。</p><p&g

106、t;　　3.2.5蛹蟲草菌絲體多糖提取工藝的優(yōu)化（熱水浸提法）</p><p>　　3.2.5.1單因素試驗</p><p>　?。?）液料比對蛹蟲草菌絲體多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，分別按液料比4∶1、7∶1、10∶1、13∶1、15∶1稱量蛹蟲草菌絲體10.0g于錐形瓶中，并于80℃熱水中提取3h，提取3次后抽濾。下清液中加入三倍體

107、積90％的乙醇，醇沉24h后抽濾得上清液，定容至100mL容量瓶中，在490nm下測定其吸光度值，確定較適宜的液料比。</p><p>　?。?）提取時間對蛹蟲草菌絲體多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比10∶1稱量蛹蟲草菌絲體10.0g于錐形瓶中，并于80℃熱水中提取1h，2h、3h、4h、5h，提取3次后抽濾。下清液中加入三倍體積90％的乙醇，醇沉24h后

108、抽濾得上清液，定容至100mL容量瓶中，在490nm下測定其吸光度值，確定較適宜的提取時間。</p><p>　?。?）乙醇濃度對蛹蟲草菌絲體多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比10∶1稱量蛹蟲草菌絲體10.0g于錐形瓶中，并于80℃熱水中提取3h，提取3次后抽濾。下清液中加入三倍體積的乙醇，乙醇濃度為70%，80％，90％，100%，醇沉24h后抽濾得上清液

109、，定容至100mL容量瓶中，在490nm下測定其吸光度值，確定較適宜的乙醇濃度。</p><p>　?。?）提取溫度對蛹蟲草菌絲體多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比10∶1稱量蛹蟲草菌絲體10.0g于錐形瓶中，并分別于溫度60℃，70℃，80℃，90℃，100℃熱水中提取3h，提取3次后抽濾。下清液中加入三倍體積的90％乙醇，醇沉24h后抽濾得上清液，定容至

110、100mL容量瓶中，在490nm下測定其吸光度值，確定較適宜的提取溫度。</p><p>　?。?）提取次數(shù)對蛹蟲草菌絲體多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比10∶1稱量蛹蟲草菌絲體10.0g于錐形瓶中，并于溫度為80℃熱水中提取3h后抽濾，且分別提取1次，2次，3次，4次，5次。下清液中加入三倍體積的90％乙醇，醇沉24h后抽濾得上清液，定容至100mL容量

111、瓶中，在490nm下測定其吸光度值，確定較適宜的提取次數(shù)。</p><p>　　3.2.5.2 正交實驗</p><p>　　在單因素試驗的礎(chǔ)上，選取四個主要影響因素：提取次數(shù)、液料比、提取時間、提取溫度，進行L9(34)正交試驗，因素水平見表3-2，以多糖提取率為指標，確定最佳提取工藝。</p><p>　　表3-2 正交試驗表</p><p