藥學(xué)畢業(yè)論文魷魚墨多肽對pc-3細胞的增殖抑制研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　魷魚墨多肽對PC-3細胞的增殖抑制研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 藥學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　目 錄

3、 </p><p>　　摘要錯誤!未定義書簽。</p><p>　　Abstract錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1、前言4</b></p><p>　　1.1魷魚墨多肽的研究概述4</p><p>　　1.2研究方法概述5</p><p>

4、　　2、實驗材料、儀器與試劑5</p><p>　　2.1 材料和試劑5</p><p>　　2.2 主要器材及儀器6</p><p><b>　　3、實驗方法6</b></p><p>　　3.1魷魚墨多肽最佳提取法6</p><p>　　3.1.1魷魚墨的制備6</p>

5、<p>　　3.1.2魷魚墨多肽的提取工藝6</p><p>　　3.1.3 魷魚墨多肽脫脂提取6</p><p>　　3.1.4魷魚墨多肽酸法提取正交實驗6</p><p>　　3.1.5氨基態(tài)氮含量的測定7</p><p>　　3.2魷魚墨多肽的提取7</p><p>　　3.3 HE染色法

6、7</p><p>　　3.4 MTT法7</p><p>　　4、實驗結(jié)果和討論8</p><p>　　4.1正交試驗及數(shù)據(jù)處理8</p><p>　　4.2 HE染色法制作常規(guī)切片8</p><p>　　4.3 MTT比色法檢測情況11</p><p><b>　　5、

7、小結(jié)12</b></p><p><b>　　參考文獻12</b></p><p>　　魷魚墨多肽對PC-3細胞的增殖抑制研究</p><p>　　[摘要] 目的：研究魷魚墨中提取的多肽對于前列腺癌中PC-3細胞的增殖抑制的作用。方法：采取MTT法和HE染色法后流式細胞儀分析及顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察等方法。結(jié)果：與對照組比較，MTT

8、法顯示對PC-3細胞的增殖抑制作用增強；HE染色法顯示細胞凋亡增多。結(jié)論：魷魚墨中提取多肽對PC-3細胞具有增殖抑制作用。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 魷魚墨多肽；PC-3細胞；增殖抑制</p><p>　　Squid ink peptides on PC-3 cell apoptosis research</p><p>　　[Abstract] Object

9、ive: Study of protein extracted from squid ink for the PC-3 prostate cancer cells in early apoptosis effect. Methods: MTT method and after HE staining and flow cytometry methods such as morphological observation under a

10、microscope. Results: Compared with control group, MTT assay showed that on the PC-3 cell proliferation enhancement; HE staining showed increased apoptosis. Conclusion: The squid ink extract protein for prostate cancer PC

11、-3 cells apoptosis inhibition.</p><p>　　[Key words] Squid ink protein; PC-3 cells; Proliferation</p><p><b>　　1、前言</b></p><p>　　前列腺是男性老年腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)前列腺癌的發(fā)病率差別很大，與地區(qū)、種族、內(nèi)在

12、因素以及周圍環(huán)境有關(guān)。前列腺癌變時一種很復(fù)雜的疾病過程，涉及遺傳學(xué)、內(nèi)分泌和其他漸變性因素。然而, 現(xiàn)階段前列腺癌的化學(xué)治療并不理想，用于治療前列腺癌的藥物主要集中于拮抗雄性激素分泌，這不僅容易產(chǎn)生激素抵抗，而且對非激素依賴的前列腺癌療效不佳。因此尋找療效確切且高效、低毒的藥物變得尤為重要。</p><p>　　海洋生物活性物質(zhì)抗腫瘤研究是海洋生物活性物質(zhì)開發(fā)與抗癌藥物研究的一個重要領(lǐng)域。當前，如何尋找能選擇性地

13、干預(yù)癌細胞信號傳導(dǎo)、調(diào)控細胞增殖和分化活動的低分子瘤抑制物是其中的重要方向[1]。雖然魷魚加工量巨大，但有關(guān)其加工過程中產(chǎn)生的大量廢棄物的綜合利用卻相對甚少。在加工過程中，其廢棄物往往被丟棄，一些國家甚至為了處理這些加工廢料損失巨大經(jīng)濟利益[2]。開發(fā)魷魚廢棄物的高值化加工的關(guān)鍵技術(shù)，全面提高魷魚廢棄物的附加值，對提升我國對大宗海洋動物資源的利用能力，提高產(chǎn)品的技術(shù)含量和競爭力，建立魷魚產(chǎn)品開發(fā)、加工的技術(shù)平臺，促進我國遠洋漁業(yè)的發(fā)展具

14、有重要的經(jīng)濟和社會意義。</p><p>　　魷魚學(xué)名中國槍烏賊，屬軟體動物門，頭足綱，二鰓亞綱，十腕目 魷魚高蛋白低脂肪，富含人體必需的多種氨基酸，且必需氨基酸組成接近全蛋白，是我國主要的水產(chǎn)加工原料[3]。我國魷魚加工主要以其胴體為主，而占魷魚體質(zhì)量1.3％左右的墨囊尚未得到有效地綜合開發(fā)利用。在美國和日本，魷魚墨汁因為安全無毒且著色力強，已被用作天然的黑色素應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。目前已研究的魷魚墨中的生物活性物

15、質(zhì)有：多肽片斷、酸性多糖等[4]。最近，又從烏賊墨中分離純化酪氨酸酶，并且發(fā)現(xiàn)有抗癌活性(最新發(fā)現(xiàn)它與腫瘤細胞發(fā)生作用)[5]。</p><p>　　1.1魷魚墨多肽的研究概述</p><p>　　20世紀80年代日本報道魷魚墨具有抗?jié)兊茸饔?，其有效成分為一種耐熱的肽多糖，可以用于生產(chǎn)保健食品的重要原料[6] 日本有在腌漬魷魚時加入墨汁的習慣，除了調(diào)味外還認為它具有防腐作用[7]。墨汁提

16、取物具有抗菌特性已被證實，但目前未確認其機理是因含有溶菌酶之故還是由其它成分所引起的。最近的研究發(fā)現(xiàn)，墨囊中含有真黑色素(eumelanin)，以共價結(jié)合、離子鍵和蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在[8]。</p><p>　　20世紀90年代，日本青森產(chǎn)業(yè)技術(shù)中心和弘前大學(xué)發(fā)現(xiàn)阿根廷魷魚墨汁具有抗腫瘤作用，并從中提取得到一種高效抗癌活性成分多糖一蛋白復(fù)合體，此種墨粘多糖由3種單糖呈直線交叉形式結(jié)合而成，并且和蛋白質(zhì)分子相連，

17、具有比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其多糖部分主要由等摩爾比例的葡糖醛酸(GIcA)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和巖藻糖(Fuc)構(gòu)成[9]。</p><p>　　魷魚是烏賊的一個種屬，其來源豐富易得，其墨汁成分和烏賊十分相似。烏賊墨的化學(xué)成分為黑色素和蛋白多糖復(fù)合體[10]。日本研究人員運用生化分離技術(shù)對烏賊墨的蛋白多耱復(fù)合體進行分析，從中分離出一組抗腫瘤活性的肽聚糖，分別是：SIPG022A、SIPG022B和SIPG

18、022C。從化學(xué)組成上看，SIPG022A和SIPG022B比SIPG022C有更多的糖組分，但用Actinase E消化后在乙酸纖維膜電泳中只顯示一個區(qū)帶，說明這三種肽聚糖中只有一種多糖鏈并被連到一種肽，其重復(fù)結(jié)構(gòu)為(-6Ga NAcal-GleA B 1-3Fuc d l一)n，只是聚合度不同。糖類部分主要含有等分子質(zhì)量的葡萄糖酸(GlcA)、N．乙酰半乳糖胺、巖藻聚糖(Fuc)。多糖部分本身無抗腫瘤活性，這表明其抗腫瘤活性來自多糖

19、同其他組分的復(fù)合體，如肽聚糖和色素嘞。肽鏈部分主要的氨基酸為：天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸[11-13]。</p><p>　　在魷魚的加工過程中，墨囊多作為加工廢棄物處理，容易污染環(huán)境，其主要化學(xué)成分是黑色素和蛋白多糖復(fù)合體。研究表明魷魚墨具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫功能、誘導(dǎo)多種細胞因子等生理活性，并一直認為其主要的活性成分為多肽片斷、酸性多糖、酪氨酸酶以及微量元素。有報道指出魷魚墨中肽聚糖可以直接抑

20、制腫瘤的生長也可以刺激機體的免疫應(yīng)答間接抑制腫瘤的生長，而肽聚糖中的主要成分是蛋白。本文研究了魷魚墨蛋白對前列腺癌中PC-3細胞具有凋亡抑制作用。</p><p><b>　　1.2研究方法概述</b></p><p>　　HE染色法又稱蘇木素-伊紅染色，蘇木素容易被氧化，其氧化產(chǎn)物蘇木紅才是真正的染料。蘇木紅是一種酸性染料，只有蘇木紅和鋁結(jié)合形成一種帶正電荷的藍色色

21、精才是堿性的。帶正電荷的藍色色精和細胞核結(jié)合是通過正、負電荷的極性吸附來完成的，也就是說，帶負電荷的脫氧核糖核酸根和帶正電荷的藍色色精進行極性吸附而完成染色[14]。伊紅是一種酸性紅色胞漿性染料，伊紅溶于水中就能離解成帶負電荷的色酸部分，即染料的有色部分;帶正電荷的鈉離子部分，即染料的無色部分。酸性染料組織成分呈彌漫性染色，這是由于組織成分的等電點一般都在 3.6～5.2范圍內(nèi)(細胞核，pH3.8～4.2；細胞漿pH4.6～5.0) [

22、15]。它們在弱酸性或弱堿性不可能進行極性吸附而完成染色，它們的染色可能是通過滲透作用或彌散作用而完成的，因此和組織成分結(jié)合是不牢固的。</p><p>　　1983年 Mosmman首先報道用MTT法來檢測細胞活性[16]。以后，又有研究人員用此法測定抗癌藥物對腫瘤增殖活性的效應(yīng)[17]。該方法簡便、 實驗周期短 (一般只需 4～6天 )、 所需細胞數(shù)目較少、人為誤差較小、所得資料較精確，且無放射性污染。因此它

23、也就成為藥物篩選的主要手段。它的原理是活細胞通過線粒體能量代謝過程，脫氫酶將MTT代謝形成藍紫色甲噆沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，形成甲噆的量與細胞增殖程度呈比例關(guān)系，通過比色分析方法測定甲胳的量，即可了解細胞的增殖情況[18]。</p><p>　　2、實驗材料、儀器與試劑</p><p><b>　　2.1 材料和試劑</b></p><p>　

24、　2.2 主要器材及儀器 </p><p><b>　　3、實驗方法</b></p><p>　　3.1魷魚墨多肽最佳提取法</p><p>　　3.1.1魷魚墨的制備</p><p>　　魷魚墨在37℃恒溫水浴鍋解凍</p><p>　　3.1.2魷魚墨多肽的提取工藝</p>&l

25、t;p>　　將預(yù)處理過的魷魚墨取10.0 mL，與適量的酸提料液,在一定的溫度、時間下浸提,并最后對浸提液離心得到的清液即為粗制的多肽。</p><p>　　3.1.3 魷魚墨多肽脫脂提取</p><p>　　將預(yù)處理過的魷魚墨取10.0 mL，與適量的酸提料液,再加適量丙酮，在一定的溫度、時間下浸提,并最后對浸提液離心得到的清液即為粗制的多肽。</p><p&g

26、t;　　3.1.4魷魚墨多肽酸法提取正交實驗</p><p>　　以氨基態(tài)氮為指標來優(yōu)選對酸水解制備魷魚墨多肽有影響的酸的種類、酸提料液比、酸解時間和酸解溫度。</p><p>　　根據(jù)單因素試驗設(shè)計正交試驗確定酸解制備魷魚墨多肽的工藝條件。L9（34）正交試驗設(shè)計因素和水平見表</p><p><b>　　表1因素水平表</b></p&

27、gt;<p>　　3.1.5氨基態(tài)氮含量的測定 </p><p>　　吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100ml容量瓶中，加水至標線，混勻后吸取20.0ml置于200ml燒杯中，加水60ml，開動磁力攪拌器，用0.05mol/l氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液ml數(shù)，供計算總算含量。加入10.0ml甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標準溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記

28、錄消耗氫氧化鈉標準溶液ml數(shù)。</p><p>　　同時取80ml蒸餾水置于另一200ml潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標準溶液調(diào)至pH8.2，（此時不計堿消耗量），再加入10.0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/l氫氧化鈉標準溶液滴定至pH9.2，用蒸餾水代替樣品作為試劑空白試驗。</p><p>　　氨基酸態(tài)氮（%）=（V1- V2）×c×0.014×100/

29、(5×V)</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　V1——樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，ml；</p><p>　　V2——空白試驗加入甲醛后滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，ml；</p><p>　　c——氫氧化鈉標準溶液的濃度

30、，mol/l；</p><p>　　0．014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。</p><p>　　3.2魷魚墨多肽的提取</p><p>　　經(jīng)正交實驗得到最優(yōu)魷魚墨中蛋白的提取條件是魷魚墨與0.01mol/L的鹽酸以1:2的比例相混合，在35 ℃的水浴鍋中經(jīng)72小時的酸化后，取出樣品。用高速冷凍離心機對樣品進行離心，離心時間為20min。</p>

31、<p>　　離心取得上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對樣品進行濃縮，在用冷凍干燥儀干燥24小時。得到魷魚墨多肽樣品。</p><p><b>　　3.3 HE染色法</b></p><p>　　取出培養(yǎng)有細胞的6張蓋玻片，放入培養(yǎng)皿中，有細胞面的朝上，用95%的酒精固定15min，然后用PBS洗兩次，每次時間都是1min。用蘇木素染色，染色時間為5-10min，用自來

32、水洗去多余的染料，使細胞核藍化。</p><p>　　浸入伊紅染色，染色時間為0.5-1min，用自來水洗去多余的染料。采用梯度低-高脫水的方法，用50%、75%、95%無水乙醇和對玻片脫水各5min，然后用二甲苯透明3次，每次1min，用中性樹膠封片。</p><p><b>　　3.4 MTT法</b></p><p>　　取對數(shù)生長期的前

33、列腺癌 PC-3 細胞，以0.25%胰酶消化，計數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi) 。每孔細胞密度為 1×104個，每組設(shè) 4個平行孔并設(shè)不含細胞的空白對照，37 ℃培養(yǎng) 24 h使細胞貼壁。吸掉上清液，每孔加入200μL含MTT試劑的培養(yǎng)基。</p><p>　　繼續(xù)培養(yǎng)4h，再將培養(yǎng)液吸干，加入二甲基亞砜，震蕩后，用酶標儀檢測5mg/ml、10ml/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml和30m

34、g/ml不同濃度的死亡率(檢測時每孔加150μL 10%的DMSO，震蕩使甲臢晶體溶解)。</p><p><b>　　4、實驗結(jié)果和討論</b></p><p>　　4.1正交試驗及數(shù)據(jù)處理</p><p>　　實驗采用酸的種類、酸提料液比、酸解時間和酸解溫度4個因素，每個因素取3個水平，取每份10 mL魷魚墨在不同的條件下反應(yīng)，測得的氨基態(tài)

35、氮及數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果見表2。</p><p>　　表2 影響魷魚墨多肽提取的L9（34）實驗結(jié)果分析表</p><p>　　如表2所示：從極差R 值可以看出，各因素對酸法提取魷魚墨多肽的主次順序為酸提料液比(B)> 酸解溫度(D)> 酸的種類(A)> 酸解時間(C) ，即酸提料液比是條件中影響最大的因素，酸解時間的影響最小，酸法提取魷魚墨多肽最佳組合為0.01 mol/

36、L鹽酸、酸提料液比1：2、酸解時間72h、酸解溫度35°C。</p><p>　　4.2 HE染色法制作常規(guī)切片</p><p>　　圖1 正常PC-3細胞</p><p>　　圖2 15mg/ml樣品作用細胞</p><p>　　圖3 30mg/ml樣品作用細胞</p><p>　　HE染色結(jié)果見圖1、圖2

37、和圖3。圖1是正常細胞保持原有的生長形狀，呈多邊形，細胞核大小不一，呈圓形或卵圓形，核分裂相多，核仁數(shù)目多。圖2、圖3中細胞腫脹，細胞器變形或腫大，核仁數(shù)目減少；細胞輪廓模糊，細胞質(zhì)堿性降低，巨核細胞增多；雖然核無明顯形態(tài)學(xué)變化，這是細胞增殖抑制的早期變化。</p><p>　　在某些 HE染色玻片中見到部分細胞核呈褐色或黑色，結(jié)構(gòu)不清，形似“焦化”的物質(zhì)，此種變化與二甲苯有密切關(guān)系，但它導(dǎo)致該變化的機制還有待進

38、一步的研究，可能是二甲苯揮發(fā)不凈，留下的結(jié)晶；也可能與細胞核的pH值有關(guān)。</p><p>　　4.3 MTT比色法檢測情況</p><p>　　表3 魷魚墨多肽對PC-3細胞增殖影響</p><p>　　圖4 MTT法檢測抑制率</p><p>　　MTT 法對不同濃度樣品對PC-3細胞的作用的檢測結(jié)果，表一中可以看出用魷魚墨多肽作用過的P

39、C-3細胞的死亡率都比未用魷魚墨多肽作用過的PC-3細胞要高；從表二中可以得出，在5mg/ml-30mg/ml這個范圍內(nèi)，魷魚墨多肽的濃度越高，它對PC-3細胞的增殖抑制能力也越強。</p><p>　　自50年代以來，國內(nèi)外學(xué)者對腫瘤細胞體外藥敏試驗進行了積極地探索，先后建立了多種體外藥敏試驗方法，如核酸前體摻入法、集落形成法、區(qū)別染色細胞毒法(DISC) 、四氮唑藍法(MTT法)和熒光測定微培養(yǎng)細胞毒試驗(

40、FMCA)等，試圖擺脫“菜譜式”(cookbook) 治療，而建立“量體裁衣式”(tailor)的治療，其中 MTT法是一種近年研究廣泛的方法[19]。自 80年代中期始，MTT法藥敏試驗首先應(yīng)用于急性白血病的治療中，指導(dǎo)臨床用藥，取得了良好的相關(guān)性和療效[20]。目前已逐步應(yīng)用到肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌等實體腫瘤的治療中，結(jié)果提高了藥物的選擇性，提高了化療質(zhì)量和化療個體化效果。</p><p>　　總之，MT

41、T法是一種簡便而快捷的腫瘤細胞體外藥物敏感實驗方法，值得臨床推廣應(yīng)用，以指導(dǎo)臨床個體化化療藥物的選擇。</p><p><b>　　5、小結(jié)</b></p><p>　　正交試驗得到魷魚墨與0.01mol/L的鹽酸以1:2的比例相混合，在35 ℃的水浴鍋中經(jīng)72小時的酸化后，得到最佳的魷魚墨多肽樣品。</p><p>　　用HE染色法制作常規(guī)H

42、E染色玻片對魷魚墨蛋白作用下的PC-3細胞進行形態(tài)學(xué)分析。得到以魷魚墨與0.01mol/L的鹽酸以1:2的比例相混合，在35 ℃的水浴鍋中經(jīng)72小時的酸化后，得到最佳的魷魚墨多肽樣品能使PC-3細胞增殖抑制。</p><p>　　用 MTT比色法檢測存活細胞和細胞增殖情況，對魷魚墨多肽抗前列腺素PC-3細胞進行定量分析。在5mg/ml-30mg/ml魷魚墨多肽的這個范圍內(nèi)，魷魚墨多肽的濃度越高，它對PC-3細胞的

43、增殖抑制能力也越強。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]歐陽高亮,李祺福,田長海.海洋生物抗腫瘤活性物質(zhì)及其作用機理研究進展[J].海洋科學(xué), 2003, 27 (7) : 21～24.</p><p>　　[2]王杏珠. 日本烏賊墨的開發(fā)和利用[J] . 海洋信息, 1995, (12) : 15 .&l

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