番木瓜SGT1和RAR1的功能驗(yàn)證及WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究.pdf

1、植物在生命活動(dòng)周期中會(huì)不斷的遭受到生物和非生物脅迫，SGT1、RAR1在植物的抗病信號(hào)傳導(dǎo)過程中的作用非常重要，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)各種脅迫方面有著提高抗性的重要作用，從不同的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)SGT1、RAR1的功能進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式及功能進(jìn)行研究揭示其抗性機(jī)理，為番木瓜抗病性研究篩選出候選的抗性基因提供有力的依據(jù)。PGA作為一種有無害無毒、可降解、無殘留等特性的物質(zhì)在農(nóng)作物上的也開始廣泛的應(yīng)用

2、，目前已發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)作物的生長(zhǎng)與增強(qiáng)植物抗病及抗逆境能力，而PGA使植物增強(qiáng)了對(duì)逆境的適應(yīng)和抗逆性的機(jī)制有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因pBI121-RAR1擬南芥R1、R2、R3三種株系與T1代轉(zhuǎn)基因pBI121-SGT1擬南芥S1、S2、S3三種株系之間通過表型、抗性和相關(guān)抗性基因的表達(dá)來對(duì)SGT1、RAR1兩個(gè)基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證;對(duì)番木瓜進(jìn)行加入外源PGA處理，并且對(duì)其進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其中10個(gè)WRKY

3、基因的表達(dá)水平。主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　 ⑴通過從主根長(zhǎng)度和花軸長(zhǎng)度這兩個(gè)方面對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行對(duì)比分析結(jié)果差異明顯;在滲透脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系R1、R2、R3中的發(fā)芽率明顯高于野生型，證明了RAR1在植物生長(zhǎng)發(fā)育初期起著重要的作用，而在各株系之間抗脅迫的能力又不相同，株系R3在甘露醇條件下的發(fā)芽率明顯高于R2和R1，株系S2和S3的發(fā)芽率也明顯高于S1;觀察在滲透脅迫條件下對(duì)根長(zhǎng)變化的影響，結(jié)果顯示6種轉(zhuǎn)基因株系

4、比野生性對(duì)脅迫條件的敏感性程度更高，而轉(zhuǎn)基因pBI121-RAR1株系相對(duì)于轉(zhuǎn)基因pBI121-SGT1株系在鹽(NaCl)脅迫中的敏感程度也更高，說明了RAR1和SGT1在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期對(duì)滲透脅迫的抗性反應(yīng)起到一定的作用;氧化脅迫實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果為在氧化脅迫的條件下48 h后，葉片出現(xiàn)的褐化干枯最嚴(yán)重的是野生型，在pBI121-SGT1的3種株系pBI121-RAR1的3種株系的葉片也發(fā)生了褐化干枯的現(xiàn)象，不過相對(duì)于野生型有所延遲;

5、用擬南芥的離體葉片對(duì)其接種核盤菌，當(dāng)侵染時(shí)間為20 h時(shí)，所有轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)病率明顯低于野生型的發(fā)病率。當(dāng)病原菌侵染葉片40 h后，野生型的葉片上已經(jīng)幾乎布滿了病斑，而在6種轉(zhuǎn)基因株系的葉片上的病斑擴(kuò)散現(xiàn)象并不是很明顯，說明了SGT1和RAR1這兩個(gè)基因在擬南芥的抗病反應(yīng)中起著一定的作用;EDS1、NDR1、LOX2、RPP5這4個(gè)均是與抗性相關(guān)的基因，在pBI121-SGT1的3種株系和pBI121-RAR1的3種株系和野生型(Col

6、-0)擬南芥中經(jīng)NaCl所誘導(dǎo)的非生物脅迫和生物信號(hào)分子SA、MeJA、ABA所誘導(dǎo)的生物脅迫后，這些與抗性相關(guān)基因的表達(dá)量在有的轉(zhuǎn)基因株系中高于野生型，說明了抗性相關(guān)基因的表達(dá)情況受到了SGT1和RAR1基因的超表達(dá)的影響。但轉(zhuǎn)基因不同株系中各與抗性相關(guān)基因的表達(dá)量又不盡相同，這說明可能與植物的激素水平和外源基因拷貝數(shù)相關(guān)系。
　　 ⑵以施加含有PGA營(yíng)養(yǎng)液的番木瓜苗（實(shí)驗(yàn)組）相對(duì)于對(duì)照組（未含有PGA營(yíng)養(yǎng)液）的植株形態(tài)學(xué)比較

7、，實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)的更加健壯，主根也較長(zhǎng)。為研究PGA使植物增強(qiáng)了對(duì)逆境的適應(yīng)和抗逆性，對(duì)其進(jìn)行SA、低溫、干旱、PRSV病原侵染這4種逆境，處理7d后觀察各植株的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的植株的不良生長(zhǎng)狀況明顯好于對(duì)照組，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果在生理外形上對(duì)PGA增強(qiáng)植物抗性提供理論依據(jù)。
　　 ⑶對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行SA、低溫、干旱、病原菌侵染這4種逆境再對(duì)與抗性有關(guān)的10個(gè)番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)并分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)出未施加P

8、GA的對(duì)照組植株受脅迫誘導(dǎo)后，其中TF12.199、 TF12.62、 TF18.51、TF21.156這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量相對(duì)于未進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)的對(duì)照組基因的表達(dá)量差異顯著;施加PGA的實(shí)驗(yàn)植株受脅迫誘導(dǎo)后TF5.242、TF72.14、TF807.3這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量相對(duì)于未進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)的對(duì)照組的基因的表達(dá)量差異極其顯著。這10個(gè)番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子都參與了植物的抗性反應(yīng)調(diào)控中。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況不盡相同，說明