豬慢病毒載體pLL-Myc和pLL-Klf4的構(gòu)建.pdf

1、近年來(lái)為避開(kāi)倫理學(xué)爭(zhēng)論，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)病毒表達(dá)載體向小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入四種轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4，可使小鼠皮膚成纖維細(xì)胞重新編程，產(chǎn)生類(lèi)似于胚胎干細(xì)胞的多能性細(xì)胞，建立誘導(dǎo)性多潛能干（induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞）細(xì)胞系。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)c-Myc和Klf4基因已知序列，設(shè)計(jì)合成c-Myc和Klf4引物，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）獲取編碼豬

2、的c-Myc和klf4基因片段，從胎豬生殖嵴中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增得到豬c-Myc和Klf4基因，回收純化；然后經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切反應(yīng)，以T4連接酶連接c-Myc、Klf4基因片段和T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH-5α后經(jīng)Amp篩選、PCR鑒定及基因測(cè)序鑒定重組克隆，測(cè)序結(jié)果證實(shí)c-Myc和Klf4基因與已知基因序列吻合；用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)目的片段和pLEGFP-N1載體進(jìn)行雙酶切，分別回收純化，得

3、到c-Myc、Klf4基因雙粘片段和pLEGFP-N1雙粘線(xiàn)性質(zhì)粒，以T4連接酶將二者連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、挑菌、搖菌，通過(guò)菌體PCR擴(kuò)增鑒定顯示成功構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLEGFP-Myc、pLEGFP-Klf4；用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)pLEGFP-Myc、pLEGFP-Klf4和pLentiLox3.7載體進(jìn)行酶切，分別回收純化，將得到的酶切產(chǎn)物Myc-GFP、Klf-GFP和pLentiLox3.7用T4連接酶進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選，挑菌