表達AMV，WCMV外殼蛋白基因的紅三葉T1，T2代分子生物學檢測及抗病性分析.pdf

1、紅三葉病毒病是除根節(jié)線蟲之外的一大病害，其中尤以苜?；ㄈ~病毒（Alfalfa Mosaic Virus，AMV）和白三葉花葉病毒（White Clover Mosaic Virus，WCMV）最為猖獗。大面積草地噴施農藥不僅成本高，而且會造成環(huán)境污染，對畜產品的安全性也有影響。培育抗AMV和WCMV的轉基因紅三葉新品種是解決問題的根本途徑。要實現(xiàn)轉基因植物的多抗效果，目前常用的方法有：構建雙元、多元載體，然后進行遺傳轉化；給已經轉入一個

2、抗性基因的植株用轉基因手段再轉入另外一個抗性基因；在不同的抗病轉基因植株之間進行人工雜交。 本研究以抗苜蓿花葉病毒（AMV）轉基因紅三葉和抗白三葉花葉病毒（WCMV）的轉基因紅三葉人工雜交后代T1，T2代植株為研究對象，探討目的基因在人工雜交后代中的表達情況及其抗病性強弱。研究結果如下； 1）分別用改進的CTAB法和植物基因組試劑盒提取34個T1代植株DNA樣品和30個T2代植株DNA樣品及1個非轉基因對照DNA樣品，經

3、瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有條帶均清晰無污染，利用試劑盒提取DNA較手提法時間短、質量好。對提取的30個T2代植株的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶完整、清晰。 2）34株T1代植株PCR檢測結果顯示，5株AMV、WCMV陽性，6株WCMV陽性，1株AMV陽性，3株僅nptⅡ陽性。 3）30株T2代PCR檢測結果顯示所有T2代植株nptⅡ均呈陽性，其中10株AMV、WCMV均陽性，13株WCMV陽性、3株AMV陽性。

4、 4）對T2代轉基因紅三葉進行RT-PCR檢測，分別得到預期大小的條帶。其中，9個正常轉錄并表達AMV和WCMV外殼蛋白基因，3個表達AMV外殼蛋白基因，6個表達WCMV外殼蛋白基因，3個表達nptⅡ基因。 5）30株T2代植株有21株能夠表達外殼蛋白基因，表明外源基因可以通過人工雜交遺傳至后代，并在大部分植株中能夠正常轉錄，并且，通過人工雜交能夠實現(xiàn)兩種外源基因在同一植株中的累集。 6）對T2代陽性植株進行苜?；ㄈ~病