曼氏裂頭蚴cDNA文庫的構(gòu)建及免疫學(xué)篩選.pdf

1、曼氏迭宮絳蟲病是由絳蟲綱，假葉目，雙葉槽科的曼氏迭宮絳蟲寄生于犬、貓等多種動物的肌肉、皮下、胸腹腔等處引起的一種寄生蟲病。曼氏裂頭蚴病是由曼氏迭宮絳蟲的中絳期-裂頭蚴（Sparganum）于人體寄生所致，該病可歸納為以下幾種，即眼裂頭蚴病、皮下裂頭蚴病、口腔頜面部裂頭蚴病、腦裂頭蚴病以及增殖型裂頭蚴病。該病在我國分布廣泛，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失，同時也嚴重危害人類的健康，是一種重要的人畜共患病。目前關(guān)于本病的免疫預(yù)防研究還較少，為

2、此本研究首先建立了曼氏裂頭蚴的eDNA文庫，然后利用免疫學(xué)篩選獲得了2個持續(xù)陽性的克隆子并進行了序列測定與功能預(yù)測，主要的研究結(jié)果如下：
　　 1、曼氏裂頭蚴的cDNA文庫的構(gòu)建
　　 以TRIZOL試劑提取的曼氏裂頭蚴總RNA為模板，以含SfiⅠ B酶切位點的oligo（dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用LD-PCR技術(shù)以改良的oligo（dT）引物合成雙鏈cDNA，經(jīng)蛋白酶K和SfiⅠ消化后，過CHROMA

3、SPIN-400柱進行分級分離。雙鏈cDNA與載體λTrip-Ex2兩臂連接，體外包裝后構(gòu)建成曼氏裂頭蚴的cDNA噬菌體表達文庫。經(jīng)測定文庫容量為：初始文庫的滴度為1.04×106 pfu/mL，擴增文庫的滴度為7.8×108pfu/mL，結(jié)果表明：成功的構(gòu)建了曼氏裂頭蚴cDNA文庫。
　　 2、曼氏裂頭蚴的cDNA文庫的免疫學(xué)篩選
　　 利用制備的經(jīng)過去除大腸桿菌抗體后的感染曼氏裂頭蚴的人的陽性血清對已構(gòu)建的曼氏裂頭蚴

4、cDNA文庫進行免疫學(xué)篩選，篩選了大約2.0×104個重組的噬菌體，共獲得12個初篩陽性克隆。將初篩陽性克隆進行了3次復(fù)篩，直至全部反應(yīng)陽性，共獲得2個持續(xù)陽性反應(yīng)的克隆子分別編號W1和W2，將編號為W1和W2的兩個陽性克隆子經(jīng)噬菌體λTriplE×2轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒載體pTriplE×2后，插入序列經(jīng)自動測序儀測定后，序列送BLAST服務(wù)站進行同源性分析發(fā)現(xiàn)W1和W2基因分別為與增殖裂頭蚴SOD（超氧化物歧化酶）基因同源性96％，與增殖裂頭