沙田柚(3x、4x)與紅江橙(4x)多倍體基因組變異及其DNA甲基化分析.pdf

1、多倍化是植物進(jìn)化的主要推動(dòng)力，常常伴隨發(fā)生大量遺傳與表觀遺傳變異，使植物出現(xiàn)新的表型，如抗旱、抗病蟲、花期、器官大小等，使植物能夠更好的適應(yīng)生存環(huán)境的需要。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾形式，普遍存在于高等植物中，并在控制基因表達(dá)、維持基因組的穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)一方面運(yùn)用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplifiedfragment length polymorphism，AFLP)分析沙田柚和紅江橙在多倍化過(guò)程中基因組結(jié)

2、構(gòu)的變異；另一方面運(yùn)用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)對(duì)其DNA甲基化水平和遺傳模式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，期望可以從基因組結(jié)構(gòu)和DNA甲基化兩個(gè)方面初步探討柑橘多倍體的遺傳與進(jìn)化模式，對(duì)果樹多倍體遺傳特性、雜種優(yōu)勢(shì)形成以及倍性育種等方面的研究具有重要意義，其主要結(jié)果如下： 沙田柚天然和人工多倍體基因組AFLP分析結(jié)果表明：18對(duì)引物共擴(kuò)增出912個(gè)

3、位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為382個(gè)，占41.89％。按與二倍體差異位點(diǎn)數(shù)由多到少排序，依次為X14(266)、X18(252)、X8(249)、X5(243)、X1(242)、X7(241)、X6(240)、X4(239)、X17(213)、X3(213)、X15(207)、X12(198)、X16(195)，變異率在21％～29％之間，表明沙田柚多倍體基因組在多倍化中發(fā)生了大量變異，推測(cè)是多倍體表型變異的主要原因之一。人工多倍體基因組變異

4、率較天然的高，起源方式相同的多倍體基因組相似度更高，暗示了多倍體基因組的變異不完全是一個(gè)隨機(jī)事件。 天然紅江橙多倍體基因組AFLP分析結(jié)果顯示：18對(duì)共擴(kuò)出2107條帶，平均每對(duì)引物117條，其中，差異帶180條，占總擴(kuò)增數(shù)的8.21％，條帶增加的位點(diǎn)有43個(gè)，占總差異位點(diǎn)數(shù)的23.89％，條帶缺失的位點(diǎn)有137個(gè)，占76.11％。總體來(lái)看，各四倍體單株與二倍體對(duì)照的總差異位點(diǎn)數(shù)大致相當(dāng)，X19為61個(gè)(8.74％)，X20為5

5、7個(gè)(8.14％)，X2為62個(gè)(8.74％)，較之沙田柚多倍體大為降低，表明不同物種對(duì)基因組加倍的耐受力不盡相同。分析差異位點(diǎn)出現(xiàn)位置發(fā)現(xiàn)，同時(shí)有條帶增加的位點(diǎn)有8個(gè)，而同時(shí)缺失的位點(diǎn)達(dá)33個(gè)，占總差異位點(diǎn)數(shù)的68.3％，表明多倍體基因具有較高的相似度，結(jié)合變異率較低，推測(cè)紅江橙四倍體均由珠心胚加倍形成。 沙田柚多倍體基因組DNA甲基化分析結(jié)果顯示，18對(duì)引物共擴(kuò)出9688條帶，其中甲基化位點(diǎn)為2368個(gè)，包括全甲基化位點(diǎn)為1

6、369個(gè)，半甲基化位點(diǎn)999個(gè)，多態(tài)性達(dá)24.4％。多倍體總甲基化率在21.6％～30.2％間，平均為23.8％。與二倍體對(duì)照總甲基化率26.0％比較，多倍體總體上差異不大。但多倍甲基化模式較二倍體進(jìn)行了大量調(diào)整，包括單態(tài)性位點(diǎn)(A型)，1413個(gè)(36.2％)；去甲基化類型(B型)，954個(gè)(24.5％)；過(guò)或超甲基化類型(C型)1057個(gè)(27.1％)；次甲基化類型(D型)437個(gè)(12.3％)。主要發(fā)生了過(guò)或超甲基化，被認(rèn)為是抑制

7、某些基因的表達(dá)；其次是去甲基化，被認(rèn)為是激活某些基因的表達(dá)。 對(duì)紅江橙多倍體及其二倍體對(duì)照基因組DNA進(jìn)行甲基化分析，18對(duì)引物共擴(kuò)出2245個(gè)位點(diǎn)，其中，甲基化位點(diǎn)為644個(gè)，包括328個(gè)全甲基化位點(diǎn)和316個(gè)半甲基化位點(diǎn)。四倍體各單株總甲基化率分別為X19(30.64％)、X20(31.01％)和X2(28.24％)，較二倍體的25.04％有所提高；全甲基化率分別為X19(15.23％)、X20(15.05％)、X2(14.

8、21％)，較二倍體的13.99％略有提高。各四倍體單株甲基化模式均有大量調(diào)整，其中以過(guò)或超甲基化類型(C型)為主，占33.29％，其次是去甲基化(B型)，占13.45％，最少的是次甲基化(D型)，占11.98％，多倍體通過(guò)調(diào)整DNA甲基化模式進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控。 綜上所述，沙田柚與紅江橙多倍體基因組結(jié)構(gòu)較二倍體均發(fā)生了大量變異，推測(cè)為同源基因重組、外源基因的導(dǎo)入所致。多倍體DNA甲基化模式進(jìn)行了大量調(diào)整，引起基因的表達(dá)與調(diào)控變異