轉(zhuǎn)AtDCL2、AtDCL4和AtRDR6基因水稻研究.pdf

1、DCL2、DCL4、RDR6是RNA干擾(RNA interference,RNAi)機(jī)制關(guān)鍵基因,在RNAi的起始、維持和沉默擴(kuò)散過(guò)程中起關(guān)鍵作用。RNAi是植物體天然的抗病毒防御體系,利用RNAi技術(shù)進(jìn)行植物抗病毒研究是近年來(lái)植物病毒學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。在目前利用RNAi開(kāi)展抗病毒研究中,主要是通過(guò)導(dǎo)入病毒來(lái)源的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)或發(fā)夾RNA(hairpin RNA,hpRNA)誘發(fā)針對(duì)同

2、源病毒的高效RNAi效應(yīng),最終表現(xiàn)出植物體對(duì)病毒高度甚至免疫抗性。本研究中嘗試通過(guò)過(guò)量表達(dá)RNAi機(jī)制中參與病毒抗性的關(guān)鍵基因、增強(qiáng)RNAi在起始階段對(duì)病毒復(fù)制時(shí)形成的dsRNA的切割作用,從而賦予植物體對(duì)病毒更高的抗性。這拓寬了目前利用RNAi進(jìn)行抗病毒研究的思路,有助于豐富植物抗病毒種質(zhì)創(chuàng)制的策略。
　　 在RNAi機(jī)制研究中,以擬南芥為材料開(kāi)展的參與RNAi的生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究最為深入,因此我們克隆擬南芥DCL2、D

3、CL4和RDR6基因開(kāi)展本研究工作?？寺　y(cè)序結(jié)果表明,AtDCL2編碼區(qū)由4125個(gè)核苷酸構(gòu)成,AtDCL4編碼區(qū)由5660個(gè)核苷酸構(gòu)成；AtRDR6編碼區(qū)由3591核苷酸構(gòu)成。隨后將3個(gè)基因分別連入真核表達(dá)載體pCV1300,并將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將AtDCL2導(dǎo)入水稻幼胚及成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中,最終獲得以幼胚為材料的轉(zhuǎn)基因株系有9株,經(jīng)PCR、PCR-Southern blot鑒定證明其中有8株為陽(yáng)性植株,

4、以成熟胚誘導(dǎo)的愈傷作為受體的轉(zhuǎn)DCL2再生植株有82株,其中PCR陽(yáng)性植株70株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將AtDCL4導(dǎo)入水稻幼胚及成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中,最終獲得以幼胚為材料的轉(zhuǎn)基因株系有81株,經(jīng)PCR、PCR-Southern blot鑒定證明其中有79株為陽(yáng)性植株,以成熟胚誘導(dǎo)的愈傷作為受體的轉(zhuǎn)DCL4再生植株有86株,其中PCR陽(yáng)性植株76株；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的AtRDR6轉(zhuǎn)化水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷實(shí)驗(yàn)中,最終獲得128株再生植株,

5、其中PCR陽(yáng)性植株113株。RT-PCR結(jié)果表明外源基因能夠正常表達(dá)。
　　 在克隆AtDCL2過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)AtDCL23’非翻譯區(qū)序列的長(zhǎng)度不一,對(duì)所有序列進(jìn)行元件掃描分析表明,它們含有不同的順式元件。為深入分析不同AtDCL23’UTR是否影響了其上游編碼區(qū)的表達(dá),我們選取其中的X6,M11,M12和M6為研究對(duì)象,把它們?nèi)诤系紾FP的下游,利用real-time PCR分析融合不同3’UTR的GFP在煙草葉片中的瞬時(shí)表

6、達(dá)情況。結(jié)果表明GFP-X6的GFP mRNA的積累量要比沒(méi)有融合序列的GFP的對(duì)照高出1倍以上,GFP-M6的mRNA表達(dá)量為對(duì)照的70％,GFP-M11和GFP-M12都只有對(duì)照表達(dá)水平的30％。結(jié)果說(shuō)明不同的3’UTR確實(shí)影響了其上游編碼區(qū)的表達(dá)水平。綜合分析3’UTR調(diào)控基因表達(dá)結(jié)果與各自的序列結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子搜尋發(fā)現(xiàn):M11與X6相比,在3’端延長(zhǎng)的53 nt序列中包含了一個(gè)SBF-1結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)ARE元件。我們分別或同時(shí)突變