兩個(gè)棉花AP2-EREBP基因的鑒定及功能研究.pdf

1、棉花是世界上一種重要的的經(jīng)濟(jì)作物，產(chǎn)量高，成本低，在許多國(guó)家都有進(jìn)行大面積的種植，如我國(guó)、印度和美國(guó)等。棉花是重要的油料作物，又是主要的纖維作物，同時(shí)也是紡織業(yè)和化工業(yè)的重要原料來(lái)源。因此，分離鑒定出那些與棉纖維發(fā)育相關(guān)的基因，研究它們的表達(dá)模式以及功能，對(duì)于提高棉花產(chǎn)量及改良纖維品質(zhì)具有重要的意義。
　　AP2/EREBP蛋白是植物體內(nèi)的一類轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。AP2/EREBP家族至少含有一個(gè)高度

2、保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，根據(jù)所含的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)，分為AP2亞家族（含兩個(gè)）和EREBP亞家族（含一個(gè)）。目前一些關(guān)于AP2/EREBP基因的研究報(bào)道表明，AP2亞家族的研究集中在花的發(fā)育和側(cè)根的發(fā)育方面，而EREBP亞家族的研究則主要集中在脅迫應(yīng)答和抗性方面。而對(duì)于EREBP亞家族與棉花纖維生長(zhǎng)發(fā)育方面的影響卻少有報(bào)道。因此，有必要進(jìn)一步研究該類基因的作用機(jī)理和信號(hào)傳遞途徑，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供更多可靠的理論依據(jù)。

3、
　　我們從棉花cDNA文庫(kù)中篩選了兩個(gè)編碼AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子的基因，命名為GhERF1和GhRAP2.1。對(duì)其表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位以及功能進(jìn)行了研究,取得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.GhERF1和GhRAP2.1基因的分離鑒定與進(jìn)化分析
　　從棉花的cDNA文庫(kù)中分離鑒定了2個(gè)編碼AP2/EREBP的基因，命名為GhERF1和GhRAP2.1。GhERF1的cDNA開(kāi)放閱讀框(ORF)為678bp，編碼的蛋白質(zhì)

4、由226個(gè)氨基酸組成。GhERF1蛋白結(jié)構(gòu)包括一個(gè)AP2/EREBPdomain，且AP2/EREBPdomain內(nèi)的第14位為A和第19位為D，屬于ERF家族成員。進(jìn)化分析表明，GhERF1蛋白與楊樹PtERF32蛋白、擬南芥AtERF1蛋白的同源性較高，親緣關(guān)系較近。GhRAP2.1的cDNA開(kāi)放閱讀框(ORF)為462bp，編碼的蛋白質(zhì)由154個(gè)氨基酸組成。GhERF1蛋白結(jié)構(gòu)包括一個(gè)AP2/EREBPdomain，且AP2/ER

5、EBPdomain內(nèi)的第14位為V和第19位為E，屬于DREB家族成員。進(jìn)化關(guān)系分析表明，GhRAP2.1與楊樹PtDREB35、蓖麻RcDREB1B及擬南芥AtRAP2.1、AtRAP2.9、AtRAP2.10同源性較高，親緣關(guān)系較近。
　　2.GhERF1和GhRAP2.1基因在棉花不同組織及纖維發(fā)育階段的表達(dá)分析
　　棉花不同組織表達(dá)分析結(jié)果顯示:GhERF1在棉花的根和纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在其它組織中表達(dá)量很低或幾乎無(wú)表

6、達(dá)。GhRAP2.1在纖維、根、真葉中表達(dá)最高，下胚軸、花藥、子葉其次，在花瓣和胚珠中沒(méi)有表達(dá)。對(duì)這兩個(gè)基因在纖維不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明GhERF1在9DPA和12DPA纖維中表達(dá)量最高，GhRAP2.1在6DPA纖維中表達(dá)量最高。
　　3.棉花GhERF1基因在ACC，IAA，TIBA處理下的誘導(dǎo)表達(dá)
　　我們用ACC、IAA、TIBA對(duì)棉花10DPA離體胚進(jìn)行處理，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析了GhERF1

7、基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，GhERF1的表達(dá)受到ACC、IAA、TIBA的影響，且在2h的時(shí)候就被迅速誘導(dǎo)。這些結(jié)果說(shuō)明GhERF1可能參與了生長(zhǎng)素信號(hào)途徑和乙烯信號(hào)途徑，同時(shí)也間接說(shuō)明生長(zhǎng)素信號(hào)途徑和乙烯信號(hào)途徑之間可能存在著交叉。
　　4.棉花AP2/EREBP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活分析
　　將三個(gè)棉花GhAP2基因與PGBKT7載體相連后，轉(zhuǎn)化到AH109和Y187酵母菌株中，研究這三個(gè)GhAP2基因的轉(zhuǎn)錄激活活性。研究結(jié)果顯

8、示，GhERF1蛋白和另一個(gè)GhAP2蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活功能，而GhRAP2.1蛋白不具備轉(zhuǎn)錄激活功能。
　　5.GhERF1蛋白和GhRAP2.1蛋白的亞細(xì)胞定位分析
　　構(gòu)建了GhERF1:eGFP和GhRAP2.1:eGFP融合表達(dá)載體，通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥后，在共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光，結(jié)果顯示:GhRAP2.1定位于細(xì)胞核上。GhERF1的定位情況還需要繼續(xù)研究。
　　6.GhERF1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗

9、的表型分析
　　為研究GhERF1在植物中的功能，我們構(gòu)建了GhERF1過(guò)量表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化擬南芥后，獲得了5個(gè)Line的純合體，半定量分析顯示GhERF1基因在這5個(gè)Line中都有表達(dá)，選擇L10、L11、L17和L19為后續(xù)表型分析研究對(duì)象。
　　在黑暗情況下，GhERF1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的下胚軸和根長(zhǎng)比野生型明顯要短一些;在光照情況下，GhERF1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根長(zhǎng)比野生型短。
　　7.IA

10、A和ACC對(duì)于GhERF1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀挠绊?br>　　用不同激素對(duì)GhERF1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)微量的IAA可部分回復(fù)ACC造成的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)目減少的表型。說(shuō)明GhERF1基因可能在乙烯信號(hào)途徑和生長(zhǎng)素信號(hào)途徑的交叉過(guò)程中起到了一定的作用。
　　8.GhERF1可能通過(guò)IAA信號(hào)途徑來(lái)影響擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育
　　生長(zhǎng)素對(duì)于植物側(cè)根的發(fā)育具有非常重要的作用。在MS+0nM

11、IAA的培養(yǎng)基上，GhERF1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的側(cè)根密度明顯比野生型要大。在MS+10nMIAA的培養(yǎng)基上，GhERF1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的側(cè)根密度和野生型都有所升高，但過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的側(cè)根密度仍明顯比野生型要大。在MS+20nMIAA的培養(yǎng)基上，過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的側(cè)根密度下降，與野生型相比無(wú)明顯差異。在MS+30nMIAA、MS+50nMIAA、MS+100nMIAA的培養(yǎng)基上，過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗

12、的側(cè)根密度下降程度比野生型的大。表明在擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育過(guò)程，低濃度的生長(zhǎng)素處理時(shí)，GhERF1促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，高濃度生長(zhǎng)素處理時(shí)，GhERF1抑制側(cè)根發(fā)育。
　　9.生長(zhǎng)素應(yīng)答基因在GhERF1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的表達(dá)情況
　　分析了四個(gè)已被報(bào)道參與生長(zhǎng)素應(yīng)答的基因(IAA1，IAA3,IAA9，IAA17,IAA19，SAUR）在GhERF1轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IAA1，IAA3在GhERF1過(guò)量表達(dá)株系中表達(dá)量明顯

13、下調(diào)，IAA9，IAA17,IAA19，SAUR在GhERF1過(guò)量表達(dá)株系中表達(dá)量明顯上調(diào)，推測(cè)GhERF1可能參與了生長(zhǎng)素信號(hào)通路。
　　10.GhAP2RNAi轉(zhuǎn)基因棉花植株的獲得
　　構(gòu)建了GhAP2RNAi載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化，目前已獲得GhAP2RNAi轉(zhuǎn)基因棉花6個(gè)株系，共計(jì)30多株轉(zhuǎn)基因棉花植株;提取了3個(gè)株系的基因組DNA(gDNA)，PCR檢測(cè)表明100％為陽(yáng)性苗。轉(zhuǎn)基因棉花植株的表型分析