球孢白僵菌Ras大家族中八個小G蛋白的功能解析及其對生物防治潛能的貢獻.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是用于農(nóng)林害蟲生物防治的經(jīng)典昆蟲病原真菌，其生防潛能取決于常見侵染體分生孢子的產(chǎn)量、質(zhì)量、對靶標害蟲的毒力及抗逆力等諸多性狀。這些生防潛能相關(guān)性狀與若干細胞生物學事件密切相關(guān)，如孢子萌發(fā)、營養(yǎng)生長、孢子形成、多脅迫應(yīng)答及寄主侵染等。真核生物的Ras小GTP酶大家族成員都可作為分子開關(guān)，調(diào)節(jié)細胞生長、分化、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、細胞骨架重組等系列細胞活動，但昆蟲病原真菌的絕大多數(shù)成員尚無相關(guān)研究

2、報道。本文通過構(gòu)建和分析單基因敲除/回補菌株和正或負顯性點突變菌株，研究解析球孢白僵菌Miro、Ras3和6個Rho小GTP酶調(diào)節(jié)或參與調(diào)節(jié)的生物學功能及其對球孢白僵茵生防潛能的貢獻。主要結(jié)果摘要如下。
　　球孢白僵菌小GTP酶Miro調(diào)控對脅迫耐受性和毒力至關(guān)重要的線粒體分布和流動性Miro同源蛋白是真核細胞中廣泛存在的一類線粒體靶向的小G蛋白，屬于Ras小GTP酶大家族，但在絲狀真菌中的研究報道幾近空白。球孢白僵菌中存在唯一的

3、Miio同源蛋白bMiro，通過整體、截頭或去尾的亞細胞定位研究，證明bMiro在線粒體外膜上的亞細胞定位完全依賴于其C末端45個氨基酸殘基組成的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)。bMiro的功能缺失導致菌絲細胞中線粒體的聚集分布、總量減少及流動性降低，以致胞內(nèi)ATP含量大幅下降，但并不致線粒體的形態(tài)發(fā)生變化。在限制性培養(yǎng)基上，敲除株Δbmiro對Ca2+、Mn2+、Zn2+和Mg2+的耐受力較野生株分別提高42％、37％、19％及10％。此外，敲

4、除株的重要表型出現(xiàn)不同程度的缺陷，如孢子萌發(fā)緩慢，營養(yǎng)生長較弱，分生孢子耐高溫、抗紫外輻射的能力及毒力下降，但對氧化和高滲脅迫無顯著應(yīng)答反應(yīng)。所有表型變化都在回補株中恢復到野生株的水平。結(jié)果表明，球孢白僵菌bMiro調(diào)控的線粒體分布及運動是ATP釋放能量運輸金屬離子所必須的，因而對球孢白僵菌的生防潛能具有顯著貢獻。
　　新的Ras小GTP酶Ras3在Hog1信號通路上游發(fā)揮作用從而調(diào)控球孢白僵菌的產(chǎn)孢、多脅迫應(yīng)答及毒力真菌中關(guān)于R

5、as1和Ras2兩個Ras小GTP酶協(xié)作或反向調(diào)節(jié)若干細胞事件的研究報道很多，罕見有第三個Ras蛋白存在的報道。本研究證明球孢白僵菌和許多其他絲狀真菌中存在另一個Ras同源蛋白即Ras3。生物信息學結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示，絲狀真菌中的Ras3擁有Ras家族典型的5個結(jié)構(gòu)域和兩個GTP/GDP開關(guān)，只是Ras3蛋白C末端通常與膜定位相關(guān)的CAAX基序中半胱氨酸的位置從倒數(shù)第四位移至倒數(shù)第二位，但這一位移被證明并不影響其在球孢白僵菌細胞質(zhì)膜上的定

6、位。在球孢白僵菌中，ras3的缺失導致ras1在野生株中的轉(zhuǎn)錄水平隨培養(yǎng)時間而顯著改變，但對ras2的轉(zhuǎn)錄表達影響不大。與野生株相比，ras3敲除株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長顯著加快，但在一些不同碳氮源貧瘠培養(yǎng)基上菌落生長速率有所減慢。正常培養(yǎng)條件下，敲除株分生孢子產(chǎn)量顯著降低，所產(chǎn)孢子耐高溫、抗紫外能力及毒力顯著下降。此外，敲除株對甲萘醌氧化脅迫的敏感性遠高于對H2O2的氧化脅迫，對高滲脅迫的敏感性遠高于胞壁干擾脅迫。敲除株對甲萘醌的高敏

7、感性吻合超氧化物歧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平及總酶活的顯著下降，而高滲敏感性不僅吻合高滲甘油(HOG)信號通路中多數(shù)信號蛋白及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Msn2的轉(zhuǎn)錄表達劇烈下調(diào)，而且吻合幾乎檢測不出的標志性激酶Hog1的表達及磷酸化信號。所有這些變化都因ras3的回補而修復。結(jié)果表明，Ras3在HOG信號通路上游扮演重要角色從而調(diào)節(jié)球孢白僵菌的產(chǎn)孢、多脅迫應(yīng)答及毒力，因而是其適應(yīng)眾多昆蟲寄主及復雜多樣環(huán)境所必需的。
　　球孢白僵菌Rho家族六個小G蛋白

8、的功能解析球孢白僵菌Rho家族由六個小G蛋白組成，其中四個的編碼基因(rho2、rho3、rho4及cdc42)分別被成功敲除和回補，而另兩個的編碼基因(rho1及racA)是敲除致死的，通過各自的正顯性(DA)和負顯性(DN)點突變而構(gòu)建突變株D Arho1、DNrho1、DAracA及DNracA。在這些敲除株和點突變株中，DNrho1、Δrho4及Δcdc42在富營養(yǎng)和不同碳氮源的貧瘠營養(yǎng)培養(yǎng)基上一致表現(xiàn)出或輕或重的生長缺陷。其中

9、，DNrho1孢子萌發(fā)大幅延遲，菌絲增粗、隔膜增多，細胞變短;Δrho4菌絲常在隔膜處斷裂成細管狀無隔單細胞，以單一或分叉出芽的方式在其一端形成一或二個橢圓狀細胞，顯示其極性生長嚴重受阻，因而生長缺陷最嚴重。Δcdc42菌絲形態(tài)變化不大，但尖端細胞延長而使極性生長異常。DNrho1的產(chǎn)孢缺陷嚴重，Δcdc42次之。其余敲除株或點突變株沒有明顯的生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)異常。在金屬離子脅迫實驗中，只有Cu2+的敏感性在Δrho2、Δrho4、DA

10、rho1、DNrho1及DNracA中顯著升高，而所有敲除株及點突變株對Mn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+等金屬離子脅迫都表現(xiàn)為抗性增強或無顯著反應(yīng)。在化學脅迫實驗中，只有Δrho4對氧化脅迫更加敏感，而其余敲除株及點突變株或更抗胞壁干擾及氧化脅迫，或?qū)@些及高滲脅迫無顯著反應(yīng)。除Δrho2和Δrho3之外的敲除株及點突變株在菌落生長期間對高溫熱激變敏感，除Δrho4之外所有敲除株及點突變株的分生孢子對UV-B紫外輻射更敏