我國(guó)部分地區(qū)雞白痢沙門菌耐藥性與耐藥基因分析.pdf

1、雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的一種嚴(yán)重的全身性感染疾病，其在發(fā)達(dá)國(guó)家已較少存在，主要分布于發(fā)展中國(guó)家，如非洲和亞洲等。在我國(guó)，雞白痢沙門菌仍是嚴(yán)重影響家禽業(yè)的致病菌之一?？咕幬锏氖褂檬欠乐坞u白痢的重要措施，但其濫用導(dǎo)致耐藥性的不斷增強(qiáng)，而且耐藥性可能通過(guò)食物鏈傳播到人類。細(xì)菌耐藥性包括先天耐藥和獲得性耐藥。獲得性耐藥相關(guān)基因通常位于可移動(dòng)元件上，攜帶耐藥因子的質(zhì)粒是傳播耐藥性的重要途徑。沙門菌耐藥性的產(chǎn)生和增強(qiáng)，對(duì)雞白痢等的防治是一個(gè)不

2、利因素，但目前關(guān)于雞白痢沙門菌耐藥性監(jiān)測(cè)及其耐藥機(jī)制的報(bào)道較少，研究數(shù)據(jù)相對(duì)匱乏。
　　為了解我國(guó)雞白痢沙門菌耐藥性流行狀況及其耐藥機(jī)制，本研究通過(guò)分析1962-2015年間我國(guó)不同地區(qū)來(lái)源的雞白痢沙門菌耐藥特性和多重耐藥狀況，并對(duì)部分國(guó)內(nèi)外菌株耐藥性進(jìn)行比較，初步掌握了我國(guó)雞白痢沙門菌總體耐藥狀況與趨勢(shì);另外，通過(guò)對(duì)50株測(cè)序菌株全基因組進(jìn)行序列分析，獲得了主要耐藥基因，分析其與耐藥性之間的關(guān)系，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)雞白痢沙門菌特有的耐

3、藥質(zhì)粒pSPUR。
　　1.我國(guó)部分地區(qū)雞白痢沙門菌耐藥性測(cè)定與分析
　　本研究測(cè)定了我國(guó)部分地區(qū)1962-2015年間的423株雞白痢沙門菌對(duì)18種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果顯示我國(guó)雞白痢沙門菌對(duì)萘啶酸的耐藥率最高，達(dá)到69.3％，其次為四環(huán)素(43.8％);對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、復(fù)方新諾明、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星和氨曲南的耐藥率也較高，分布在5.2％-22.0％之間;對(duì)頭孢噻呋、美羅培南、丁胺卡那霉素、

4、氯霉素和喹乙醇的藥物敏感性較好，耐藥率均未達(dá)到1％;而對(duì)其余四種抗菌藥物（卡那霉素、慶大霉素、恩諾沙星和呋喃妥因）的體外抑菌效果最好，無(wú)耐藥菌株出現(xiàn)。
　　我國(guó)雞白痢沙門菌對(duì)氨曲南、四環(huán)素和萘啶酸的耐藥率隨時(shí)間逐漸升高。對(duì)四環(huán)素、萘啶酸和復(fù)方新諾明耐藥的菌株主要分布在1998年及之后，對(duì)萘啶酸的耐藥率自2009年至今基本維持在100％;而對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的菌株最初出現(xiàn)在2006年，其后耐藥性一直處于較穩(wěn)定的低水平狀態(tài)。對(duì)β-內(nèi)酰胺類

5、藥物的耐藥性則是先降低后升高的趨勢(shì)。對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率雖較低，但MIC值發(fā)生變化。如環(huán)丙沙星和恩諾沙星的MIC50分別為0.015-0.03-0.03-0.03-0.5-0.5μg/mL和0.03-0.03-0.06-0.06-0.5-0.5μg/mL;呋喃妥因的MIC50和MIC90均逐漸升高:8-8-16-16-16-16μg/mL和16-16-16-16-32-32μg/mL。
　　我國(guó)雞白痢沙門菌的多重耐藥性總體呈現(xiàn)上

6、升趨勢(shì)。上世紀(jì)90年代以前的多重耐藥菌株僅出現(xiàn)在1960-1969年間，多重耐藥率為13.3％。隨后多重耐藥菌株開(kāi)始增多，多重耐藥率逐漸升高:從1990-1999年間的12.2％上升至2000-2009年間的37.4％，直至2010-2015年間的47.3％，并開(kāi)始出現(xiàn)對(duì)4-5類抗菌藥物耐藥的菌株。多重耐藥菌株主要對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類抗菌藥物表現(xiàn)耐藥。
　　將我國(guó)雞白痢沙門菌與歐洲和南美洲部分國(guó)家同時(shí)期菌株的

7、耐藥性進(jìn)行比較分析。歐洲菌株和南美洲菌株中分別有1株和2株對(duì)鏈霉素和萘啶酸耐藥，而我國(guó)同時(shí)期菌株耐藥率分布在7.1％-28.6％和3.6％-28.6％之間，明顯高于歐洲和南美洲菌株。
　　2.50株雞白痢沙門菌耐藥基因分析
　　通過(guò)BLASTn將全基因組測(cè)序的50株雞白痢沙門菌序列與耐藥基因庫(kù)ARDB進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)各菌株相關(guān)的耐藥因子。匹配值選取80％，得到50株共有的2種多重耐藥外排泵(MdtK，SdeY)、3種多重耐藥外

8、排蛋白(AcrB-TolC，MdtG, EmrD)、1種移位酶(MdfA)和春日霉素耐藥基因ksga。預(yù)測(cè)到與18種測(cè)定抗菌藥物相關(guān)的4種耐藥基因分別為aph33ib、tetA、blaTEM-1和sul1/2，分別決定鏈霉素、四環(huán)素、青霉素類藥物和復(fù)方新諾明耐藥性。在17株含有這些耐藥基因的菌株中，16株與耐藥表型一致。鏈霉素和氨芐西林的基因型和耐藥表型符合率均為100％，四環(huán)素的符合率為92％。MIC試驗(yàn)中對(duì)磺胺類藥物表現(xiàn)耐藥的菌株均

9、含有染色體上基因sul1，而含有質(zhì)粒上耐藥基因sul2和無(wú)耐藥基因菌株的MIC值為＜0.06/1.2-1/19，未達(dá)到耐藥折點(diǎn)。在喹諾酮耐藥決定突變區(qū)(QRDR)的基因中，gyrA中發(fā)生突變主要在83位(S83F)，且發(fā)生該突變菌株對(duì)萘啶酸均表現(xiàn)耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值(0.25-1μg/mL)也高于其它菌株。在gyrA其它位點(diǎn)和parE中發(fā)生的突變對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性無(wú)影響，parC基因中突變的作用無(wú)法確認(rèn)，gyrA中83位氨基酸的

10、突變是影響雞白痢沙門菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性最重要因素。
　　3.雞白痢沙門菌特異性耐藥質(zhì)粒鑒定
　　通過(guò)上述全基因序列分析發(fā)現(xiàn)在對(duì)氨芐西林高水平耐藥（MIC值≥512μg/mL）的菌株(S9303，S9804，S98109，S09c6，S09c12，S09c13，S09c15)中存在一個(gè)新的特異性耐藥質(zhì)粒pSPUR，大小在30-50 kb之間，結(jié)構(gòu)相似，且在雞白痢沙門菌中未報(bào)道。該質(zhì)粒上的主要耐藥基因?yàn)閎laTEM-1，并含

11、有IS1、IS240、Tn3和InsA四種轉(zhuǎn)座酶。該質(zhì)粒序列主要來(lái)源于兩類質(zhì)粒。質(zhì)粒接合試驗(yàn)(受體菌分別為S06004和J53AziR)中僅獲得一株受體菌為S06004的接合子，顯示該質(zhì)?？赡芫哂蟹N屬特異性。該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移使受體菌S06004對(duì)氨芐西林的MIC升高1024倍，對(duì)阿莫西林/克拉維酸也升高了32倍。電轉(zhuǎn)試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化子使受體菌J53AziR對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸和頭孢唑啉的MIC值分別升高≥512、128-256和16-