舟山眼鏡蛇細(xì)胞毒素CTX1誘導(dǎo)HL-60和KG1a死亡機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　人類急性髓性白血?。ˋcute myeloid leukemia,AML）是一種嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病，對(duì)于它的治療臨床多采用化療的方式，而傳統(tǒng)的化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生很大的毒副作用，從而引起感染、出血等嚴(yán)重的并發(fā)癥；除此之外，腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期以來對(duì)化療藥物產(chǎn)生的耐受性也成為影響治療效果的重要因素，所以尋找一種高效低毒的抗腫瘤藥物勢(shì)在必行。近年來，各專家學(xué)者對(duì)生物毒素如蛇毒的研究發(fā)現(xiàn)，其組分

2、能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，為臨床抗腫瘤治療及新藥開發(fā)提供了新的思路。
　　舟山眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素1（Cytotoxin1，CTX1）是本課題組從舟山眼鏡蛇毒中分離純化出的一種堿性小分子多肽，該多肽由60個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為6698Da，氨基酸序列為L(zhǎng)KCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVKYVCCNTDRCN。前期研究結(jié)果表明CTX1對(duì)多種白血病細(xì)胞具有選擇

3、性殺傷作用，主要引起晚期凋亡和壞死。進(jìn)一步的研究表明其引起的死亡或?yàn)樾陆l(fā)現(xiàn)并一度成為熱點(diǎn)的區(qū)別于傳統(tǒng)凋亡和壞死的一種新的死亡方式，即經(jīng)過嚴(yán)格的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的程序性壞死，又稱Necroptosis。
　　Necroptosis是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的區(qū)別于傳統(tǒng)壞死的死亡方式，它在形態(tài)上主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜完整性受到破壞等壞死的形態(tài)特征，但在分子生物學(xué)方面，它是經(jīng)過以RIP1為主的一系列蛋白的嚴(yán)格信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的，是一種誘導(dǎo)性的死亡

4、方式。
　　本研究通過探討CTX1誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60和急性髓性白血病細(xì)胞株KG1a這兩種分化程度和干性程度不同的細(xì)胞株的死亡機(jī)制來闡明CTX1作用于腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)及機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容有：1）CTX1誘導(dǎo)死亡過程中各相關(guān)死亡蛋白的表達(dá)；2) CTX1誘導(dǎo)死亡過程中ROS的作用；3）CTX1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過程中TNF-α的作用；4）干擾RIP1基因表達(dá)對(duì)CTX1誘導(dǎo)HL-60死亡的影響；5）CTX1對(duì)正常小鼠骨髓單個(gè)核

5、細(xì)胞的毒性作用；6）CTX1對(duì)溶酶體通透性的影響；
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.蛋白免疫印跡（Western Blot）法
　　檢測(cè)CTX1作用于兩種細(xì)胞后各死亡相關(guān)蛋白Caspase8、RIP1、RIP3的表達(dá)情況；
　　2.流式細(xì)胞（flow cytometry）術(shù)
　　用CM-H2DCFDA標(biāo)記ROS，檢測(cè)CTX1作用于細(xì)胞后ROS的產(chǎn)生情況；干擾RIP1后，Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)CT

6、X1對(duì)HL-60細(xì)胞的影響；
　　3. MTS法
　　檢測(cè)TNF-α中和抗體預(yù)處理后CTX1對(duì)HL-60的影響；
　　4.ATP法（CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay）
　　檢測(cè)CTX1對(duì)正常小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞（Bone Marrowmononuclear Cell，BMNC）的影響；
　　檢測(cè)ROS阻斷劑NAC預(yù)處理后CTX1對(duì)KG1a細(xì)胞的影響

7、；
　　檢測(cè)TNF-α中和抗體預(yù)處理后CTX1對(duì)KG1a的影響；
　　5. ELISA方法
　　檢測(cè)CTX1作用于細(xì)胞后上清液中TNF-α的產(chǎn)生情況；
　　6.慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　構(gòu)建針對(duì)RIP1基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，構(gòu)建干擾RIP1表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞株；
　　7.熒光顯微鏡方法
　　觀察病毒載體侵染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)GFP熒光以檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染情況；
　　8.激光

8、共聚焦技術(shù)
　　觀察CTX1作用于細(xì)胞后吖啶橙染色情況；
　　結(jié)果：
　　1. CTX1誘導(dǎo)死亡過程中各相關(guān)死亡蛋白的表達(dá)情況
　　采用Western blot的方法檢測(cè)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CTX1作用于HL-60后引起RIP1明顯上調(diào)，RIP3略微下降，凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase8下降，并呈現(xiàn)劑量依賴和時(shí)間依賴性；CTX1作用于KG1a后引起RIP3顯著升高，RIP1略有下調(diào)，Caspase8下降，也呈現(xiàn)劑量依賴和

9、時(shí)間依賴性；說明CTX1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過程中，RIP1在HL-60細(xì)胞中，RIP3在KG1a細(xì)胞中分別起到很關(guān)鍵的作用。
　　2. CTX1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過程中活性氧ROS的作用
　　用探針 CM-H2DCFDA標(biāo)記 ROS后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CTX1作用于KG1a后引起 ROS顯著升高，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（p<0.05）；而作用于HL-60后，ROS的產(chǎn)生量相對(duì)于對(duì)照組并沒有升高，反而有所降低；提示ROS在KG1a死

10、亡的下游途徑中可能發(fā)揮了一定的作用，而HL-60的死亡可能與ROS沒有很大的關(guān)系；但是應(yīng)用NAC預(yù)處理KG1a細(xì)胞阻斷ROS之后，發(fā)現(xiàn)KG1a的死亡并沒有得到逆轉(zhuǎn)，說明ROS的升高在CTX1誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞死亡過程中或只是一過性的，并不是關(guān)鍵執(zhí)行因素；
　　3. CTX1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過程中TNF-α的作用
　　CTX1作用于兩種細(xì)胞后，應(yīng)用ELISA的方法檢測(cè)上清液中TNF-α的量發(fā)現(xiàn)，CTX1作用于KG1a細(xì)胞和HL-60

11、細(xì)胞后都能引起TNF-α不同程度的升高，但是KG1a細(xì)胞升高幅度較大；應(yīng)用TNF-α中和抗體預(yù)處理后，檢測(cè)CTX1對(duì)兩種細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn)并不能逆轉(zhuǎn)兩種細(xì)胞的死亡；提示CTX1作用于細(xì)胞后能引起炎性因子TNF-α升高，但是它并不是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素。
　　4.干擾RIP1的表達(dá)對(duì)CTX1誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞死亡的影響
　　用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建針對(duì)RIP1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CTX1對(duì)細(xì)胞株的作用發(fā)現(xiàn)，干擾RI

12、P1基因表達(dá)后并不能逆轉(zhuǎn)HL-60細(xì)胞的死亡。說明 RIP1在HL-60細(xì)胞死亡過程中作用很關(guān)鍵但并不是唯一關(guān)鍵的因素。
　　5.高濃度CTX1對(duì)小鼠正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞的作用
　　用ATP的方法檢測(cè)CTX1對(duì)小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn)，CTX1對(duì)小鼠正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞并沒有明顯殺傷作用，在濃度達(dá)到5倍 HL-60細(xì)胞IC50的濃度時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞的毒性只有10％左右，說明CTX1對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度選擇性且安全范圍較寬。

13、>　　6. CTX1對(duì)溶酶體通透性影響
　　激光共聚焦顯微鏡觀察吖啶橙（AO）染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CTX1加藥組，溶酶體所染紅色熒光變?nèi)?，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光逐漸減弱，提示CTX1作用于細(xì)胞后能引起溶酶體通透性升高。
　　結(jié)論：
　　1. CTX1能夠誘導(dǎo)KG1a和HL-60以一種新的程序性壞死的方式死亡
　　2. CTX1誘導(dǎo)KG1a和HL-60程序性壞死的下游途徑存在不同的機(jī)制
　　3.高濃度的C