曼氏裂頭蚴cDNA序列的測定及Sm18抗原基因的初步鑒定.pdf

1、曼氏裂頭蚴病是由曼氏迭宮絳蟲(Spirometra mansion，Sm)的幼蟲一曼氏裂頭蚴(plerocercoid)侵入機體引起的一種人獸共患性疾病。裂頭蚴侵入皮下組織形成結(jié)節(jié)，最大危害在于侵入艮部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可致殘、嚴重危及生命[1]。我國已報道千余例曼氏裂頭蚴病例，廣泛分布于23個省、市、自治區(qū)[2]。
　　 裂頭蚴在人體內(nèi)移行，寄生部位多變，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，容易引起誤診、漏診。診斷常用方法主要有病原學(xué)、影像學(xué)和

2、免疫學(xué)方法。目前，我國曼氏裂頭蚴病診斷標準尚不明確，亦無商品化的診斷試劑面市，此病最終通過手術(shù)或活檢得以確診和治療。近年來，隨著現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)的普及，裂頭蚴病，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)病例的報道越來越多，CT、MRI、超聲檢查等影像學(xué)檢查亦是一種重要的輔助診斷。但是曼氏裂頭蚴感染者往往起病隱匿，局部包塊影像學(xué)表現(xiàn)與腫瘤難以區(qū)分，往往被誤診、漏診。免疫學(xué)檢測方法有其獨特的優(yōu)點：敏感性高、簡捷同時創(chuàng)傷性小，是一種較為理想的臨床輔助診斷手段。但是，

3、曼氏裂頭蚴與其它寄生蟲尤其是蠕蟲之間存在較為嚴重的交叉反應(yīng)，粗抗原作為診斷抗原敏感性較高，但特異性差，故其免疫學(xué)診斷的準確性不夠高。因此，利用基因重組技術(shù)制備曼氏裂頭蚴特異性抗原，對曼氏裂頭蚴病免疫診斷具有重要意義。
　　 目的：
　　 構(gòu)建了曼氏裂頭蚴cDNA文庫并進行大規(guī)模測序篩選和生物信息學(xué)分析，并從中挑選具有潛在診斷價值的抗原基因進行克隆表達，在此基礎(chǔ)上對候選分子的免疫學(xué)特性以及診斷價值進行了初步驗證，為曼氏裂頭

4、蚴的致病性及診斷方法的研究提供基因譜信息及進一步研制曼氏裂頭蚴免疫診斷試劑盒提供實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.曼氏裂頭蚴cDNA文庫的構(gòu)建、篩選及生物信息學(xué)分析
　　 利用SMART技術(shù)構(gòu)建曼氏裂頭蚴全長cDNA文庫，從cDNA文庫中隨機挑取克隆，搖菌后提取質(zhì)粒，使用通用引物PCR擴增，將PCR產(chǎn)物大小＞500bp片段進行測序。對得到的有效序列進行生物信息學(xué)分析，經(jīng)編輯后的序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST

5、N、BLASTX軟件進行分析，選取有診斷意義的基因為候選基因。
　　 2.候選基因的克隆、表達用其免疫學(xué)特性分析
　　 采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增出候選克隆的插入片段，運用直接測序技術(shù)測定插入cDNA片段的核苷酸序列，經(jīng)編輯后的序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTN、BLASTX軟件及其他生物信息學(xué)預(yù)測軟件進行分析。PCR擴增侯選基因開放讀碼框，克隆到載體pET32a(+)中，并進行誘導(dǎo)表達、純化重組蛋白后對重組蛋

6、白進行質(zhì)譜鑒定。提取曼氏裂頭蚴的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合為cDNA，設(shè)計侯選基因的特異性引物，采用RT-PCR對候選編碼基因的表達水平進行分析。用純化的重組蛋白免疫小鼠，制備抗血清，以該血清作為探針，對重組蛋白進行Western blot。以曼氏裂頭蚴感染者的血清作為免疫探針，純化的重組蛋白作為抗原進行Western blot分析。以純化融合蛋白為抗原，包被酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，用間接ELISA法檢測曼氏裂頭蚴感染者血清，評價其敏感性和特異性。應(yīng)用

7、已優(yōu)化的ELISA檢測體系，以重組Sm18作為包被抗原，對其診斷曼氏裂頭蚴感染的敏感性和特異性進行初步評價。
　　 結(jié)果:
　　 1.曼氏裂頭蚴cDNA文庫的構(gòu)建、篩選及生物信息學(xué)分析結(jié)果
　　 成功構(gòu)建了曼氏裂頭蚴cDNA文庫，從cDNA文庫中隨機挑取530個克隆，擴增其插入片段，將條帶＞500bp的487個PCR產(chǎn)物送測序，得到418條有效序列，通過聚類分析合并為325條序列，其中全長序列139條，為曼氏裂頭

8、蚴的致病性及診斷抗原的研究提供了有價值的基因表達譜信息。序列分析發(fā)現(xiàn)，第81號克隆序列編碼與GenBank中的TSES33 diagnostic antigen[Taenia solium]Genebank：CAX86983.1具有一定同源性，可能有作為診斷抗原的研究價值，其理論分子量為18kDa，為此，將該基因暫時命名為曼氏裂頭蚴診斷抗原18(diagnostic antigen ofSparganum mansion Sm18)基因

9、，并進行進一步的研究。
　　 2.Sm18的重組表達及免疫學(xué)特性鑒定結(jié)果
　　 經(jīng)PCR、酶切及測序驗證該目的基因克隆成功。將成功構(gòu)建的重組子pET32a(+)-Sm18經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，在較寬的溫度范圍和IPTG誘導(dǎo)濃度范圍內(nèi)都獲得了很好的表達；His親和層析柱純化的重組表達產(chǎn)物(rSm18)分子大小約為35kDa經(jīng)質(zhì)譜鑒定，證明是Sm18蛋白。采用RT-PCR對候選編碼基因的表達水平進行分析，結(jié)果表明Sm18在曼氏

10、迭宮絳蟲中絳期-裂頭蚴有轉(zhuǎn)錄。以制備的rSm18多抗血清為一抗進行Western blot，結(jié)果顯示重組蛋白識別到一大小約33kDa的條帶。純化后的重組蛋白rSm18能被曼氏裂頭蚴感染者血清所識別，Western Blot鑒定發(fā)現(xiàn)在33kDa左右處可見一條明顯的免疫反應(yīng)帶，而陰性對照血清在相應(yīng)的位置未識別出該蛋白條帶。以rSm18作為抗原，建立了基于ELISA的檢測特異性抗體的免疫學(xué)方法，rSm18的最佳包被濃度為12.5μg/ml，最

11、適封閉條件為5％脫脂牛奶，37℃封閉1.5h；最適血清反應(yīng)條件為1∶400稀釋，37℃溫育90min；酶標二抗1∶20000稀釋，37?！鏈赜?h；以TMB顯色2min左右為佳。間接ELISA方法對標準血清以可溶性粗抗原(PSA)為包被抗原檢測敏感性為90％，特異性為68％，符合率73％；以rSm18為包被抗原檢測感染者以及非感染者的血清敏感性為92％，特異性為81％，符合率為84％。
　　 結(jié)論:
　　 獲得了325條

12、曼氏裂頭蚴表達基因的EST序列，其中全長序列139條，為曼氏裂頭蚴的致病性及診斷抗原的研究提供了有價值的基因表達譜信息。從曼氏裂頭蚴cDNA文庫中分離到診斷抗原(Sm18)，并成功構(gòu)建了該基因的高效原核重組表達體系，制備了可以用于免疫診斷的重組抗原。Western blot結(jié)果初步顯示rSm18具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。以該分子作為抗原檢測曼氏裂頭蚴感染者血清中特異性IgG具有較高的特異性和敏感性。本研究證明rSm18在曼氏裂頭蚴