CD44基因沉默對(duì)K562-A02細(xì)胞逆轉(zhuǎn)耐藥及生物學(xué)活性的研究.pdf

1、多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是導(dǎo)致白血病化療失敗的主要因?yàn)椤６嗨幠退幨侵改[瘤細(xì)胞接觸一種抗癌藥物后產(chǎn)生的對(duì)多種結(jié)構(gòu)和功能迥異的抗癌藥物的耐受性。目前認(rèn)為它的發(fā)生機(jī)制是復(fù)雜多樣的,主要有:(1)多藥耐藥相關(guān)基因(如MDR1、MRP1、BCRP、LRP等)表達(dá)的上調(diào)；(2)凋亡相關(guān)基因(如BCL-2、BCR/ABL、P53等)表達(dá)的異常；(3)酶介導(dǎo)的耐藥,包括谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶表達(dá)升高、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的含量

2、或活性降低；(4)增強(qiáng)的DNA修復(fù)功能；(5)微環(huán)境耐藥。其中以腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)MDR-1基因編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員膜P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp,P-170,MDR1,ABCB1)為主要的機(jī)制。黏附分子CD44是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白,作為透明質(zhì)酸(HA)的受體,CD44分子的表達(dá)與白細(xì)胞的粘附、血管發(fā)生、細(xì)胞增殖、分化、遷移及淋巴細(xì)胞的活化、歸巢,以及免疫細(xì)胞的炎癥部位遷移和凝集有關(guān)。近年來(lái),許多學(xué)者提

3、出CD44在正常髓細(xì)胞生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用,CD44在造血細(xì)胞的過(guò)表達(dá)預(yù)示著血液惡性疾病預(yù)后不良。Vincent T等發(fā)現(xiàn)CD44分子與其受體HA之間的相互作用可能會(huì)影響惡性血液病細(xì)胞的存活及耐藥性。RNA干擾是利用雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘導(dǎo)序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing)現(xiàn)象,由于其高效性,高特異性,高穩(wěn)定性,可遺傳性及RNAi

4、在有效地沉默靶基因的同時(shí),對(duì)細(xì)胞本身的調(diào)控系統(tǒng)沒(méi)有影響等這些特點(diǎn),越來(lái)越受到人們的重視。本研究以K562/A02細(xì)胞為研究對(duì)象,以RNAi技術(shù)為平臺(tái)研究CD44基因與耐藥細(xì)胞株K562/A02耐藥性的關(guān)系,為逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥提供新的方法與思路。
　　 目的:構(gòu)建針對(duì)CD44基因的RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒載體,探討CD44基因表達(dá)抑制對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02耐藥性及生物學(xué)活性的影響。
　　 方法:根據(jù)CD44基因

5、表達(dá)序列設(shè)計(jì)有效的RNA干擾片段,將其構(gòu)建入質(zhì)粒表達(dá)空載體中,獲得針對(duì)CD44mRNA的特異性siRNA真核質(zhì)粒(pGCsiRNA-CD44),轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)K562/A02細(xì)胞CD44,MDR-1和BCL-2mRNA的表達(dá)；MTT法檢測(cè)阿霉素對(duì)K562/A02細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)；流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)細(xì)胞周期:Hochest33258染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。

6、r>　　 結(jié)果:針對(duì)CD44基因的siRNA真核質(zhì)粒可有效沉默K562/A02細(xì)胞的CD44基因:與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染了4條pGCsiRNA-CD44質(zhì)粒的K562/A02細(xì)胞CD44表達(dá)均明顯抑制,以轉(zhuǎn)染了siCD44-1的細(xì)胞中抑制最強(qiáng)。轉(zhuǎn)染pGCsiRNA-CD44質(zhì)粒48h后,K562/A02細(xì)胞CD44mRNA水平下降64.1％(p<0.05),同時(shí)MDR-1,BCL-2mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組分別下降了25.6％,50.8％

7、；K562/A02細(xì)胞IC50為(17.97±1.61)μg/ml,無(wú)義序列質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后阿霉素對(duì)K562/A02細(xì)胞的IC50為(16.95±1.72)μg/ml,pGCsiRNA-CD44轉(zhuǎn)染后IC50明顯降低(8.77±1.63)μg/ml(p<0.01)。轉(zhuǎn)染48h后,G0/G1期細(xì)胞比例提高了10.7％,細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核邊集、凋亡小體等改變。
　　 結(jié)論:特異性CD44siRNA可顯著抑制K562/A02細(xì)胞CD44基因