加味玉屏風(fēng)顆粒應(yīng)用于變態(tài)反應(yīng)性皮膚病的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、[背景] 近年來，全世界變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率明顯上升。在所有的變態(tài)反應(yīng)性疾病中，皮膚變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率最高。因此，對(duì)于變態(tài)反應(yīng)性皮膚病的研究，探討如何有效地預(yù)防及治療，是目前皮膚病研究的熱點(diǎn)之一。 祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)該類疾病的中醫(yī)病機(jī)進(jìn)行了深入的研究，通過辨證施治，取得了良好的療效。實(shí)驗(yàn)證明，許多中藥單體或復(fù)方均能從多層次多途徑來抑制機(jī)體變態(tài)反應(yīng)的產(chǎn)生，并且具有傳統(tǒng)西藥所不具備的綜合藥理作用優(yōu)勢(shì)。因此，運(yùn)用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)

2、研究傳統(tǒng)中草藥，尤其是純天然藥物制成的小復(fù)方制劑，將為該類疾病的臨床防治提供新的思路。 玉屏風(fēng)散是中醫(yī)扶正固表的經(jīng)典方劑，由黃芪佐以白術(shù)、防風(fēng)構(gòu)成。在臨床上廣泛用于治療哮喘、上呼吸道感染等疾病，較少有對(duì)其治療變態(tài)反應(yīng)性皮膚病的實(shí)驗(yàn)室研究。因此，根據(jù)中醫(yī)固本驅(qū)邪的理論依據(jù)及臨床經(jīng)驗(yàn)，我們?cè)谟衿溜L(fēng)散原方基礎(chǔ)上添加荊芥、當(dāng)歸、甘草等藥物，本著益氣固表、養(yǎng)血祛風(fēng)的治則，在臨床上治療變態(tài)反應(yīng)性皮膚病，取得良好療效。并進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)室建立變應(yīng)

3、性接觸性皮炎(ACD)小鼠模型，運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)加味玉屏風(fēng)顆粒治療變態(tài)反應(yīng)性皮膚病的作用機(jī)制及環(huán)節(jié)進(jìn)行深入的研究。 [目的] 1、通過研究加味玉屏風(fēng)顆粒對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠的多種臨床指標(biāo)的改善，從而探討加味玉屏風(fēng)顆粒的藥理學(xué)功效。 2、通過研究加味玉屏風(fēng)顆粒對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)的影響，探討其抑制Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的可能作用機(jī)制。 3、通過研究加味玉屏風(fēng)顆粒對(duì)小鼠外周血多種細(xì)胞因子的影響，探討其對(duì)ACD

4、小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)，尤其是對(duì)Ⅰ型及Ⅱ型細(xì)胞因子的影響。 4、通過臨床應(yīng)用加味玉屏風(fēng)顆粒治療變態(tài)反應(yīng)性皮膚病，對(duì)其人體療效做出評(píng)價(jià)。 5、觀察加味玉屏風(fēng)顆粒對(duì)濕疹患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響，探討其對(duì)濕疹患者細(xì)胞免疫的影響。 [方法] 1、建立小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型 取BALB/C小鼠50只，用DNFB作為誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前一天于腹部去毛，面積約3cm2，實(shí)驗(yàn)第0、1天在小鼠腹部均勻涂布0.

5、5％DNFB25μl致敏；實(shí)驗(yàn)第5天于小鼠左耳背部及腹側(cè)均勻涂布0.25％DNFB20μl誘發(fā)皮炎。 2、小鼠分組給藥 加味玉屏風(fēng)顆粒按國(guó)家藥典人體用量的10倍、20倍、40倍配制為低、中、高劑量。將ACD小鼠隨機(jī)分為五組，分別為生理鹽水組、陽(yáng)性對(duì)照組及中藥低劑量組、中劑量組和高劑量組。每組10只。實(shí)驗(yàn)第0、1、2日及第5日誘發(fā)前2小時(shí)及誘發(fā)后6小時(shí)灌服藥液或生理鹽水。陽(yáng)性對(duì)照組用氫化可的松24mg/kg.d。

6、3、小鼠相關(guān)臨床指標(biāo)的測(cè)定 用電子秤準(zhǔn)確稱量小鼠實(shí)驗(yàn)前后的體重差；用外徑千分尺測(cè)量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度；以打孔器取左右耳中部的組織塊稱重，計(jì)算左右耳塊的重量差；摘取小鼠脾臟及胸腺，稱重，分別計(jì)算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。 4、取小鼠左耳組織塊進(jìn)行HE染色，鏡下計(jì)數(shù)單一核細(xì)胞以及多核細(xì)胞。 5、NF-κBp50檢測(cè) 取小鼠左耳組織塊用免疫組化SP法對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp50進(jìn)行免疫組化染色，半

7、定量評(píng)分。 6、細(xì)胞因子的測(cè)定 誘發(fā)24小時(shí)后將各組小鼠摘眼球取血，分離血清。用免疫酶聯(lián)吸附ELISA法對(duì)小鼠外周血γ干擾素(IFN-γ)、白介素4(IL-4)及腫瘤壞死因子a(TNF-a)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 7、臨床觀察 用加味玉屏風(fēng)顆粒治療20例慢性蕁麻疹患者及20例慢性濕疹患者，觀察其療效、起效時(shí)間及復(fù)發(fā)率。 8、細(xì)胞免疫的檢測(cè) 經(jīng)玉屏風(fēng)顆粒治療的20例濕疹患者，在其療程開始及結(jié)束時(shí)分

8、別采取2ml外周血，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其外周血中T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞，并與正常健康人群進(jìn)行對(duì)比。 [結(jié)果] 1、實(shí)驗(yàn)小鼠體重的改變 實(shí)驗(yàn)前各組小鼠在體重方面無(wú)明顯差異。而實(shí)驗(yàn)前后的小鼠體重均有不同程度的減輕。其中生理鹽水組體重減輕較為顯著，而服用中藥中、高劑量組體重變化與生理鹽水組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。并且高劑量組優(yōu)于低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。隨著所服用加味玉屏風(fēng)顆粒劑量的增高，體重減輕

9、減少。 2、實(shí)驗(yàn)小鼠耳廓腫脹程度的改變 誘發(fā)后各組小鼠左耳均有不同程度的腫脹。中藥各組及氫化可的松組對(duì)小鼠的誘發(fā)前后的左耳重量與生理鹽水組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。并且中、高劑量組優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)。耳片厚度的改變中藥組及陽(yáng)性對(duì)照組亦優(yōu)于生理鹽水組，并且中、高劑量組優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。隨著中藥給藥劑量的增高，對(duì)小鼠耳片炎癥的抑制作用增強(qiáng)。

10、 3、實(shí)驗(yàn)小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的變化 陽(yáng)性對(duì)照組、中劑量組和高劑量組小鼠胸腺指數(shù)的改變均與生理鹽水組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；同時(shí)低劑量組、中劑量組、高劑量組均與陽(yáng)性對(duì)照組有差異(P＜0.05)；而低劑量組、中劑量組和高劑量組三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。小鼠脾臟指數(shù)的改變顯示陽(yáng)性對(duì)照組與其余各組均有差異(P＜0.05)，而中藥各劑量組與生理鹽水組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 4、實(shí)驗(yàn)小鼠耳

11、部皮膚組織病理學(xué)檢查 在ACD小鼠模型組的病理切片中可以看到有大量的單一核細(xì)胞及少數(shù)多核細(xì)胞的浸潤(rùn)，而給予中藥玉屏風(fēng)顆粒后，局部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，細(xì)胞間水腫減輕，真皮血管的擴(kuò)張程度亦隨之減輕。通過顯微鏡下計(jì)數(shù)顯示，服用中藥組小鼠的單一核細(xì)胞的浸潤(rùn)情況明顯優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，表現(xiàn)為單一核細(xì)胞計(jì)數(shù)及多核細(xì)胞數(shù)的明顯減少，并且隨著中藥劑量的增加，這一趨勢(shì)更為顯著。 5、對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ

12、Bp50表達(dá)的影響 生理鹽水組小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)可見多量NF-κBp50的表達(dá)，表現(xiàn)為胞漿及部分胞核可見棕黃色顆粒沉著。而氫化可的松組小鼠耳片組織中僅可見散在胞漿表達(dá)或無(wú)表達(dá)，胞核基本未見表達(dá)。在中藥治療組中，我們觀察到隨著中藥給藥劑量的增高，NF-κBp50的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，多數(shù)表現(xiàn)為在胞漿的散在表達(dá)或無(wú)表達(dá)，無(wú)明顯的核內(nèi)表達(dá)，并且表達(dá)范圍及強(qiáng)度均低于生理鹽水組(P＜0.05)。 6、對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠外周血IF

13、N-γ及IL-4含量的影響 與生理鹽水組相比，中藥各組IFN-γ明顯降低(P＜0.05)，并且中高劑量組與低劑量組亦有明顯差異(P＜0.05)。而陽(yáng)性對(duì)照組及各中藥組與生理鹽水組相比IL-4表達(dá)亦降低(P＜0.05)，中藥組組間比較無(wú)明顯差異；IFN-γIL-4比值亦隨著中藥劑量的增高，呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。通過組間比較發(fā)現(xiàn)，中藥組高劑量組優(yōu)于中低劑量組，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。 7、對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠外周TNF-a的影響 中藥組

14、小鼠TNF-a值均較生理鹽水組明顯下降(P＜0.05)。通過兩兩比較顯示，高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異，但優(yōu)于中低劑量組(P＜0.05)。 8、各細(xì)胞因子與小鼠耳廓腫脹程度及耳廓重量差的相關(guān)分析 通過相關(guān)分析顯示，小鼠的耳片重量及厚度差均與小鼠的IFN-γ、IL-4、TNF-a呈正相關(guān)(P＜0.05)，并且與IFN-γ及TNF-a相關(guān)尤為密切，相關(guān)系數(shù)分別為0.837、0.775(IFN-γ)及0.713、0.729(

15、TNF-a)。 9、加味玉屏風(fēng)顆粒治療慢性蕁麻疹及慢性濕疹的療效評(píng)價(jià) 10、經(jīng)加味玉屏風(fēng)顆粒治療的慢性濕疹患者外周血細(xì)胞免疫的檢測(cè) [結(jié)論] 1、加味玉屏風(fēng)顆?？捎行е委熍R床上常見的慢性蕁麻疹及慢性濕疹這兩種變態(tài)反應(yīng)性皮膚病。雖然治療較抗組胺藥物起效慢，但可明顯減少該類疾病的復(fù)發(fā)率。其機(jī)制與其可調(diào)節(jié)機(jī)體的T細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)。 2、加味玉屏風(fēng)顆?？捎行б种茖?shí)驗(yàn)小鼠的變應(yīng)性接觸性皮炎，減輕小鼠皮膚

16、炎性腫脹并可抑制局部單一核細(xì)胞及多核細(xì)胞的浸潤(rùn)。 3、加味玉屏風(fēng)顆?？捎行б种坪宿D(zhuǎn)錄因子NF-κBp50的激活及向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，從而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制皮膚炎癥的發(fā)生。 4、加味玉屏風(fēng)顆?？捎行ё饔糜跈C(jī)體的免疫系統(tǒng)，抑制炎癥前細(xì)胞因子TNF-a的表達(dá)，并調(diào)節(jié)Ⅰ類細(xì)胞因子IFN-γ及Ⅱ類細(xì)胞因子IL-4之間的平衡。其對(duì)于機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)作用，可能為其抗變態(tài)反應(yīng)的作用靶點(diǎn)及可能機(jī)制之一。 [小結(jié)] 本研究將中西

17、醫(yī)理論結(jié)合，在西醫(yī)疾病中引入中醫(yī)衛(wèi)氣營(yíng)血理論，從全面調(diào)整機(jī)體免疫入手，用加味玉屏風(fēng)顆粒來治療變態(tài)反應(yīng)性皮膚病，取得了良好的效果。并首次通過現(xiàn)代藥理研究方法對(duì)加味玉屏風(fēng)顆粒治療變態(tài)反應(yīng)性皮膚病的藥理藥效機(jī)制進(jìn)行了深入研究。研究方法宏觀與微觀相結(jié)合，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床研究及一系列實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，既建立動(dòng)物模型以觀察其宏觀藥效學(xué)指標(biāo)，又通過病理組織學(xué)檢查、免疫組化技術(shù)、ELISA技術(shù)、流式細(xì)胞儀技術(shù)等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)加味玉屏風(fēng)顆?？棺儜B(tài)反應(yīng)的作用機(jī)