細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物及其調(diào)節(jié)亞基Cdh1在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化中的作用.pdf

1、研究背景和目的：
　　 神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，是近十幾年來移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)。Cdh1是細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex，APC)的調(diào)節(jié)亞基，在增殖細(xì)胞中，它通過泛素化降解特定的底物蛋白起著調(diào)控細(xì)胞周期的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)其在成熟神經(jīng)元中有大量表達(dá)，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突生長、突觸傳遞及神經(jīng)元存活的作用。本研究我們擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察Cdh1在中樞神經(jīng)細(xì)

2、胞中的表達(dá)分布特點(diǎn)，體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，觀察ATRA誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化時(shí)Cdh1的表達(dá)變化規(guī)律；再通過篩選Cdh1 RNA干擾有效靶點(diǎn)，構(gòu)建Cdh1 RNA干擾慢病毒載體，探討Cdh1下調(diào)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Cdh1 在中樞神經(jīng)細(xì)胞中的作用，為選擇Cdh1作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法與結(jié)果：
　　 1. APC-Cdh1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)分布特點(diǎn)

3、
　　 方法：取健康成年雄性SD大鼠腦部制作冰凍切片，免疫組化染色檢測Cdh1的表達(dá)部位，分別用抗神經(jīng)元核（NeuN）抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）免疫熒光雙標(biāo)檢測Cdh1表達(dá)的細(xì)胞定位情況。取出生24h內(nèi)乳鼠，原代培養(yǎng)神經(jīng)元及神經(jīng)干細(xì)胞。免疫組化檢測NeuN 進(jìn)行神經(jīng)元鑒定。Nestin 染色進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞初步鑒定，加入胎牛血清誘導(dǎo)其分化，免疫組化染色檢測GFAP和MAP2的表達(dá)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的分化特性。分別提取神經(jīng)干細(xì)胞

4、與成熟神經(jīng)元總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測APC 兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基Cdh1與CDC20的表達(dá)。
　　 結(jié)果：大鼠腦組織切片免疫組化DAB 染色顯示Cdh1 在海馬、皮層均有大量表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)顯示Cdh1表達(dá)主要定位于神經(jīng)元中，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較少。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元光鏡下可見胞體和較長的細(xì)胞突起，NeuN免疫染色為陽性，純度達(dá)90%以上。原代神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)至第4～5 d 即形成神經(jīng)球，Nestin 染色鑒定為陽性，并能分化為神經(jīng)

5、元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示與神經(jīng)干細(xì)胞相比，神經(jīng)元中Cdh1 mRNA表達(dá)升高(1.00±0.05 vs 2.10±0.07，P<0.05)，但CDC20 mRNA 幾乎沒有表達(dá)（1.00±0.04 vs 0.02±0.01,P<0.05）。
　　 2. 全反式維甲酸誘導(dǎo)原代神經(jīng)干細(xì)胞分化時(shí)Cdh1表達(dá)的變化
　　 方法: 取出生24h內(nèi)乳鼠，原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)至第3 代時(shí)，將神經(jīng)球接種在預(yù)先用0.

6、001%多聚鳥氨酸包被的培養(yǎng)皿中，加入ATRA誘導(dǎo)分化。分為3組：對(duì)照組、1μmol/L ATRA組、10μmol/L ATRA組，對(duì)照組中僅加入等量的DMSO，其終濃度為0.1%。于誘導(dǎo)開始時(shí)、誘導(dǎo)第4天、第8天提取細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測Cdh1的表達(dá)；于誘導(dǎo)第8天，采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測MAP2和GFAP的表達(dá)觀察神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞分化情況；采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測1μmol/L ATRA誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化時(shí)

7、Id2 mRNA表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，對(duì)照組、1μmol/L ATRA、10μmol/L ATRA誘導(dǎo)組神經(jīng)干細(xì)胞分化為MAP2 陽性神經(jīng)元的比例依次為（19.1±2.8）%、（41.4±0.8）%、（34.3±1.0）%（P<0.05），其中以1μmol/L ATRA組神經(jīng)元分化比例最高。與誘導(dǎo)開始時(shí)相比，誘導(dǎo)第4天、第8天對(duì)照組Cdh1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），1μmol/L A

8、TRA組與10μmol/L ATRA組Cdh1 mRNA表達(dá)均升高（P<0.05），且以1μmol/L ATRA組在誘導(dǎo)第8天Cdh1 mRNA表達(dá)最高（P<0.05）。1μmol/L ATRA誘導(dǎo)過程中，誘導(dǎo)第4天、第8天神經(jīng)干細(xì)胞Id2 mRNA表達(dá)均較誘導(dǎo)開始時(shí)降低（P<0.05）。
　　 3. 大鼠Cdh1基因RNA干擾有效靶點(diǎn)的篩選
　　 方法：根據(jù)大鼠Cdh1基因的編碼序列設(shè)計(jì)3個(gè)干擾序列及對(duì)照序列，根據(jù)pE

9、NTR/H1/TO中間載體說明書設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的DNA單鏈，退火后連接到pENTR/H1/TO 線性載體上，形成完整載體，挑取陽性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，送生物公司進(jìn)行測序鑒定。采用脂質(zhì)體法分別將測序鑒定成功構(gòu)建的3個(gè)干擾載體和對(duì)照載體轉(zhuǎn)染大鼠永生化神經(jīng)前體細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染含綠色熒光蛋白的pEGFP-C1 質(zhì)粒作為對(duì)照，評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48h 提取細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測Cdh1 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：經(jīng)1%瓊脂

10、糖凝膠電泳初步鑒定重組載體大小正確，約為3kb。經(jīng)DNA測序鑒定構(gòu)建的3個(gè)干擾載體和對(duì)照載體插入的序列均正確，無堿基突變或缺失。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h、48h熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞，即為成功轉(zhuǎn)染的永生化神經(jīng)前體細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24h與48h細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為（54±5）%、（36±4）%。與轉(zhuǎn)染對(duì)照載體相比，轉(zhuǎn)染3個(gè)干擾載體細(xì)胞Cdh1的表達(dá)分別為1.15±0.31、0.37±0.06、0.51±0.08，以第2個(gè)干擾載體

11、下調(diào)作用最為明顯（P<0.05）。
　　 4. 大鼠源性Cdh1基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　 方法：針對(duì)已經(jīng)篩選確定的Cdh1基因RNAi 有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成雙鏈DNA，與Age I和EcoR I 雙酶切后的pGCSIL-GFP 載體［含U6啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白（GFP）］連接產(chǎn)生LV-Cdh1 RNAi 慢病毒載體，PCR 篩選陽性克隆，測序鑒定。將重組載體與pHelper

12、 1.0 (含gag/pol 元件)載體、pHelper 2.0 (含VSVG 元件)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，濃縮后分裝。采用逐孔稀釋滴度測定法將其感染293T細(xì)胞，根據(jù)GFP 蛋白的表達(dá)水平計(jì)算病毒滴度。分別將LV-Cdh1 RNAi 慢病毒及對(duì)照慢病毒感染PC12細(xì)胞，于感染后72h，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別采用RT-PCR 及western blot檢測Cdh1的表達(dá)。
　　 結(jié)果：經(jīng)PCR和測序證實(shí)

13、，成功構(gòu)建Cdh1基因RNA干擾的慢病毒載體LV-Cdh1RNAi。包裝慢病毒，濃縮病毒懸液的滴度為7×10P8PTU/ml。RT-PCR及western blot檢測顯示感染LV-Cdh1 RNAi慢病毒的PC12細(xì)胞較感染對(duì)照慢病毒及未感染細(xì)胞Cdh1表達(dá)明顯降低（P<0.05）。
　　 5. 慢病毒介導(dǎo)的Cdh1 RNA干擾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響
　　 方法：原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞至第3 代，采用含綠色熒光蛋白（G

14、FP）的對(duì)照慢病毒，分別以MOI 值=1、5、10、20、50和100 進(jìn)行慢病毒感染，感染后72h 采用熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)，確定慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞合適的MOI。再選擇MOI=20進(jìn)行慢病毒感染，分為未感染組、對(duì)照慢病毒感染組（LV-control組）、Cdh1 RNA干擾慢病毒感染組（LV-Cdh1 RNAi組）。分別于感染后24h、48h、72h 采用MTT法檢測Cdh1 RNA干擾慢病毒感染對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。于感染

15、后72h，采用2%胎牛血清誘導(dǎo)分化，4d后提取細(xì)胞總蛋白，采用western blot檢測MAP2和GFAP的表達(dá)，觀察慢病毒介導(dǎo)的Cdh1 RNA干擾對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。
　　 結(jié)果：慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞合適的MOI 為10～50。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，感染后24h、48h LV-control組與LV-Cdh1 RNAi組吸光度較未感染組增加（P<0.05），但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；感染后72h，LV-Cdh1 RNAi組較

16、LV-control組及未感染組吸光度均增加（P<0.05）。Western blot檢測顯示LV-Cdh1 RNAi組MAP2表達(dá)較LV-control組及未感染組降低（P<0.05），三組GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P

17、<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)論：
　　 1. APC-Cdh1 在大鼠腦組織中有大量表達(dá)，且主要定位于神經(jīng)元；體外實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)元中Cdh1表達(dá)高于神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 2. ATRA 成功誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，1μM ATRA誘導(dǎo)時(shí)，神經(jīng)元分化比例最高，伴有Cdh1 mRNA表達(dá)上調(diào)，及其下游底物Id2 mRNA的表達(dá)下調(diào)。
　　 3. 采用永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞及pENTR/H1/