小麥矮腥黑穗菌常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究.pdf

1、小麥矮腥黑穗病(Wheat dwarf bunt disease, DB)是麥類黑穗病中危害最大、極難防治的國(guó)內(nèi)外檢疫性病害之一,是由小麥矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn, TCK)引起的。主要分布在美洲、歐洲、北非和西亞,尤其是美國(guó)西北部7州。TCK與其近源種小麥網(wǎng)腥黑穗病菌(Tilletia caries(DC)Tul, TCT)在孢子形態(tài)、基因組水平上都具有很高的相似性,極難區(qū)分。國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾經(jīng)利用

2、rDNA的轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphi c DNA,RAPD)、重復(fù)片段PCR(Repetitive-element PCR, rep-PCR)基因指紋分析等方法分析腥黑穗菌的種內(nèi)及種間差異,都沒(méi)有成功區(qū)分開(kāi)TCK和TCT。TCK與TCT的孢子形態(tài)學(xué)上非常相似,極難分辨。因此能否精確鑒定這兩種腥黑穗病菌對(duì)于順利完成檢疫工作都是至關(guān)重要的。隨著輸華疫麥的大量流入,加之

3、幾種腥黑穗菌在形態(tài)上相互交叉,形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)工作量大,耗時(shí)費(fèi)事,主觀性強(qiáng),不能滿足進(jìn)境原糧檢疫的快速通關(guān)以及進(jìn)境后疫麥中病原菌消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)與流向監(jiān)控的需求。因此建立TCK早期、快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的分子檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。本研究以篩選到的1322bpTCK獨(dú)有差異基因設(shè)計(jì)TCK特異性引物對(duì),建立TCK常規(guī)和定量熒光PCR技術(shù)體系,并研制出快速檢測(cè)試劑盒。其研究成果將有助于對(duì)種子、土壤、原糧加工副產(chǎn)品、飼料和廢棄物上病菌冬孢子流向和存活力進(jìn)行動(dòng)態(tài)

4、監(jiān)測(cè),為制定科學(xué)的病害風(fēng)險(xiǎn)管理策略和監(jiān)控方案提供技術(shù)支撐。論文主要研究結(jié)果如下:①優(yōu)化了堿裂解法破冬孢子外壁-CTAB破壞原生質(zhì)體,釋放核酸-微量DNA過(guò)濾柱去除色素、多酚等PCR抑制物質(zhì)的TCK/TCT冬孢子提取方法,排除了冬孢子細(xì)胞壁難破DNA難以提取,三甲胺、色素等PCR抑制物質(zhì)導(dǎo)致假陰性的難題,采用此方法提取的腥黑穗菌DNA完全適用于PCR擴(kuò)增。對(duì)于TCK/TCT菌絲體DNA,采用了CTAB法和氯化芐法的大量提取。對(duì)于田間樣品,

5、FTA卡法制樣則實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)程田間樣品的快速制備保存與安全寄送。②建立了常規(guī)PCR檢測(cè)體系。利用本實(shí)驗(yàn)室前期篩選的TCK獨(dú)有的1322bp端粒差異片段,設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)CQUTCK2/CQUTCK3、CQUTCK4/CQUTCK5和CQUTCK6/CQUTCK7,優(yōu)化了PCR反應(yīng)條件,建立了三套常規(guī)PCR檢測(cè)體系,其DNA擴(kuò)增靶帶分別為747bp、200bp和644bp。選擇重組質(zhì)粒作為檢測(cè)中的陽(yáng)性對(duì)照,健康小麥和健康黑麥基因組DNA作為陰

6、性對(duì)照。以腥黑穗菌屬通用引物對(duì)CQUTC6/CQUTC7為內(nèi)置對(duì)照,可以確定被檢樣品是否含PCR抑制物質(zhì)進(jìn)而判斷檢測(cè)體系是否正確,同時(shí)有效地排除樣品檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性和假陰性。利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)CQUTCK2/CQUTCK3、CQUTCK4/CQUTCK5和CQUTCK6/CQUTCK7進(jìn)行TCK PCR檢測(cè),其特異性高,能擴(kuò)增出美國(guó)全套小麥矮腥黑穗菌不同生理小種菌株的DNA片段,而對(duì)TCT的不同菌株和其他近源種DNA都不能擴(kuò)增;PCR檢測(cè)

7、靈敏度可以達(dá)到0.1pg。采用建立的TCK PCR特異檢測(cè)技術(shù)體系,可以快速地鑒別小麥矮腥黑穗菌冬孢子和病菌純培養(yǎng)菌絲體。③首次建立了小麥矮腥黑穗菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR, RTi-PCR)檢測(cè)體系。根據(jù)差端粒差異基因片段的堿基序列,運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)篩選出適用于SYBR Green I熒光染料和TaqMan雜交探針的定量PCR檢測(cè)的特異性引物對(duì)CQUTCK4/CQUTCK5及探針CQUP1,優(yōu)化RTi-PC

8、R反應(yīng)體系,成功地建立了兩種特異、準(zhǔn)確的小麥矮腥黑穗菌RTi-PCR檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)中用TCK的DNA重組質(zhì)粒梯度稀釋液建立了RTi-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。兩種RTi-PCR檢測(cè)體系對(duì)DNA重組質(zhì)粒靶片段的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1～2 fg,對(duì)TCK基因組DNA的檢測(cè)靈敏度可達(dá)5～10 fg,比常規(guī)PCR的靈敏度高出2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。可以快速鑒別小麥矮腥黑穗菌冬孢子和檢測(cè)罹病小麥植株體內(nèi)病菌的侵染菌絲體,實(shí)現(xiàn)了田間病害的早期診斷。④對(duì)來(lái)自田間或小麥加工

9、廠的帶菌樣品進(jìn)行了雙盲檢測(cè)。運(yùn)用常規(guī)PCR對(duì)人工摻加病菌冬孢子的小麥樣品進(jìn)行了實(shí)際檢測(cè),結(jié)果顯示能準(zhǔn)確擴(kuò)增出健康小麥中每50克小麥攜帶的4000個(gè)TCK冬孢子。對(duì)混雜的小麥網(wǎng)腥黑穗菌DNA沒(méi)有擴(kuò)增條帶;運(yùn)用檢測(cè)體系分別對(duì)2006～2007年間采自國(guó)內(nèi)的196個(gè)黑穗菌菌癭或罹病小麥植株樣品進(jìn)行實(shí)際檢測(cè),結(jié)果顯示三套檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果是一致的,說(shuō)明所建立的PCR檢測(cè)體系是穩(wěn)定可靠。分別采用兩種PCR對(duì)小麥不同生長(zhǎng)期的發(fā)病情況進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),

10、常規(guī)PCR沒(méi)有靶帶產(chǎn)生,而實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)最早可在三葉期或返青期早期檢出罹病小麥樣品的陽(yáng)性信號(hào)。根據(jù)定量PCR監(jiān)測(cè)結(jié)果分析,罹病植株體內(nèi)病原菌的侵染菌絲體數(shù)量DNA含量極低,低于常規(guī)PCR的檢測(cè)下限約100x。說(shuō)明熒光定量PCR檢測(cè)體系靈敏度高于常規(guī)PCR檢測(cè)體系,更適合于小麥系統(tǒng)侵染性病害的無(wú)癥樣品的早期監(jiān)測(cè)。⑤利用大分子穩(wěn)定化技術(shù)初步研制了固相化檢測(cè)試劑盒樣盒。采用核酸、酶的穩(wěn)定劑結(jié)合真空冷凍干燥技術(shù)成功制備出TCK的分子檢