Mycobacterium tuberculosis鐵載體合成相關基因Rv1345(fadD33)的過表達對宿主菌生理功能的影響研究.pdf

1、結(jié)核病至今仍是一種嚴重危害人類健康的傳染病。全球近1/3的人口感染過其致病菌--結(jié)核分枝桿菌。人們對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)進行了廣泛研究，使得人類對結(jié)核病的控制取得了可喜的成績，一定程度上遏制了結(jié)核病的蔓延和傳播。然而由于醫(yī)患不規(guī)范不合理用藥、艾滋病與結(jié)核病聯(lián)合感染、人口流動的增加以及耐藥結(jié)核病菌的流行，使得近年來結(jié)核病疫情下降緩慢，在部分地區(qū)甚至有所回升。全球每年新發(fā)結(jié)核病數(shù)量仍在

2、增長，尤其是非洲地區(qū)、地中海東部和東南亞地區(qū)。當前，在結(jié)核病控制工作中急需開發(fā)出有效的預防性、治療性疫苗和新型藥物。尋找新的結(jié)核藥物作用靶點和開發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為當前科研領域最為關注的熱點。
　　 鐵離子是生命活動的必需元素，是各種生命活動重要酶的輔因子，如氧化酶、羥化酶、參與氧原子傳遞的酶等；參與氧化磷酸化和能量供應的細胞色素也需要鐵離子。缺失鐵離子會導致重大的有機體生理功能缺陷。鐵離子對致病菌同樣重要。然而，宿主體內(nèi)，尤

3、其是胞內(nèi)，鐵離子很有限，因此，病原菌，如主要棲居在單核巨噬細胞中的結(jié)核菌，只有成功獲取宿主中的鐵離子才能成功感染和繁殖。
　　 鐵載體是一種小分子螯合劑，對鐵離子具有很高的親和力，是致病菌獲取鐵離子的重要工具。研究表明，鐵載體與微生物的存活和致病性密切相關。例如，在缺鐵環(huán)境中，缺失鐵載體的銅綠假單胞菌生長嚴重受抑，即使感染了燒傷小鼠，也不具有毒性；在巨噬細胞中，不能合成鐵載體分支菌素的結(jié)核分枝桿菌生長嚴重受抑制。此外，鐵載體的合

4、成還對分枝桿菌抗氧化壓力有關。鑒于鐵載體對MTB的重要作用，鐵載體已成為尋找抗結(jié)核藥物先導物的重要“模特”，已獲得了一些有潛力的抗菌/抑菌組分。
　　 結(jié)核分枝桿菌鐵載體有水溶性的羧化分支菌素和細胞壁相關的分支菌素兩種，前者被分泌到胞外掠奪宿主的鐵離子，轉(zhuǎn)遞給細胞壁上的分支菌素，再被轉(zhuǎn)遞進胞內(nèi)滿足自身生理需要。結(jié)核分枝桿菌鐵載體的合成需要一系列酶的聯(lián)合作用。目前，雖然鐵載體生物合成的總體框架已經(jīng)勾勒出來，但結(jié)核分枝桿菌Rv134

5、4、fadD33和fadE14是否是分支菌素(mycobactin)生物合成基因簇成員尚存在爭議。
　　 Krithika等認為Rv1345(FadD33)是結(jié)核分枝桿菌鐵載體生物合成酶之一，主要負責激活鐵載體尾鏈合成所需的脂肪酸基序。另外，有研究證明FadD33利于MTB在肝臟及肝癌細胞系中的生長和毒力。探索MTB FadD33對鐵載體合成和分泌的影響及其對宿主菌其他生理功能的影響，有助于完善對結(jié)核分枝桿菌鐵載體合成機制的認識

6、，為抗結(jié)核藥物設計提供信息。
　　 本文主要將MTB H37Rv的分支菌素/羧化分支菌素合成基因fadD33(Rv1345)分別在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中進行克隆表達并研究其對宿主菌的生長、抗氧化壓力、鐵載體分泌以及脂肪酸構成的影響。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得M.tuberculosis H37Rv fadD33(Rv1345)的核苷酸序列，設計引物，以MTB H37Rv全基因組為模板，體外擴增獲，得gadD33(Rv1345

7、)基因。Ⅰ)在Escherichia Coli中，我們通過TA克隆，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector，然后亞克隆至載體pET32a(+)，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測定證明pET32-Rv1345重組質(zhì)粒構建成功。接著，我們研究了過表達FadD33對E.Coli生長能力、抗H2O2能力和鐵載體分泌能力的影響。實驗結(jié)果顯示FadD33的過表達有利于重組大腸桿菌的生長，但是對E.Coli抗氧化壓力和鐵載體合成

8、分泌能力無顯著影響。Ⅱ)在M.smegmatisMC2155中，我們通過TA克隆將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector后，再克隆至穿梭質(zhì)粒pNIT-myc中，經(jīng)質(zhì)粒抽提、PCR驗證、雙酶切驗證以及測序證明重組質(zhì)粒pNIT-myc-Rv1345構建成功。接著，我們研究了FadD33過表達對恥垢分枝桿菌抗氧化壓力、生長和鐵載體分泌的影響。最后，我們通過GC檢測了重組菌與空載對照的脂肪酸組成。實驗結(jié)果顯示：FadD33過