人呼吸道合胞病毒F蛋白非復(fù)制型重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus，RSV)廣泛分布于世界各地，是導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染最重要的病毒病原。病毒感染機(jī)體后的免疫保護(hù)機(jī)制尚未明確，也無(wú)特異性防治方法。RSV融合糖蛋白(fusionglycoprotein，F(xiàn))和吸附蛋白(attachmentglycoprotein，G)是RSV僅有的兩種中和抗原。RSV只有一種血清型，主要由于G蛋白抗原性的差異，可進(jìn)一步分為A和B兩種

2、抗原亞型。F蛋白在RSV不同亞型間具有高度的抗原同源性，是主要的交叉保護(hù)性抗原。本研究擬克隆RSVF基因，采用非復(fù)制型腺病毒載體，利用同源重組方法，構(gòu)建含有F基因的非復(fù)制型腺病毒重組體，獲得一株可表達(dá)RSVF的非復(fù)制型重組腺病毒FGAd/HRSVF，用于體內(nèi)免疫效果及免疫保護(hù)作用的研究。 方法：本文根據(jù)F基因堿基序列，設(shè)計(jì)并合成引物，以F基因逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，采用高保真DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增，得到F基因編碼序列。然后克

3、隆到pGEM-3zf載體中，序列測(cè)定正確后，將其亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，酶切鑒定，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，應(yīng)用Westernblot方法分析F基因表達(dá)情況。將F基因亞克隆于腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，PmeⅠ線(xiàn)性化重組穿梭載體，與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在E.coliBJ5183細(xì)胞內(nèi)同源重組得到重組腺病毒DNA質(zhì)粒。以PacⅠ酶切獲得的重組腺病毒DNA分子，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生基因

4、組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒。Westernblot鑒定目的基因表達(dá)。 結(jié)果：采用RT-PCR法擴(kuò)增獲得F蛋白基因編碼序列。核酸序列分析顯示沒(méi)有發(fā)生無(wú)義突變。轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，利用Westernblot方法檢測(cè)到了F蛋白的特異性條帶。進(jìn)一步克隆至腺病毒穿梭載體pShuttleCMV，在E.coliBJ5183內(nèi)和腺病毒骨架載體pAdeasy-1實(shí)現(xiàn)同源重組，獲得克隆有RSVF的重組腺病毒質(zhì)粒pFGAd/HRSVF，經(jīng)PacⅠ線(xiàn)性化