山茱萸防治糖尿病腎病活性部位群的篩選及其作用與機(jī)理研究.pdf

1、第一部分高糖致腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響
　　 目的：觀察不同濃度的葡萄糖作用48h對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)增殖的影響。方法：加入的葡萄糖終濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80mmol/L，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48h后，采用MTT比色法于酶聯(lián)免疫測(cè)定儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。結(jié)論：根據(jù)葡萄糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖作用的量效及時(shí)效關(guān)系，我們選擇30mM濃度的葡萄糖作用48h為最合適的細(xì)胞刺激條件。
　　

2、 第二部分山茱萸防治糖尿病腎病活性部位群的篩選
　　 一、體外篩選
　　 目的：運(yùn)用中藥血清藥理學(xué)方法研究山茱萸活性部位群對(duì)高糖致RMC增殖的體外抑制作用，并與總提取物組進(jìn)行比較，優(yōu)選山茱萸防治糖尿病腎病的最佳活性部位群組合。方法：采用四甲基氮唑鹽(MTT)比色法。結(jié)果：山茱萸各有效部位合理組合后，具有不同程度對(duì)抗高糖致RMC的增殖作用，并呈一定程度的量效關(guān)系。結(jié)論：初步確定山茱萸總苷配伍多糖為防治糖尿病腎病的最佳活性

3、部位群。
　　 二、整體篩選
　　 目的：研究山茱萸防治糖尿病腎病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，確定有效部位在藥效靶點(diǎn)上的作用，追蹤活性部位(群)。方法：分離、純化山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷、三萜酸，多糖，以環(huán)烯醚萜總苷為基礎(chǔ)將各有效部位進(jìn)行合理組合，以DN模型下的降血糖、降血清尿素氮活性及降腎指數(shù)為指標(biāo)，并與總提取物組進(jìn)行比較，篩選、確定山茱萸防治DN的有效部位群。結(jié)果：山茱萸各有效部位合理組合后，均能延緩小鼠腎病變的進(jìn)程及降低腎病變的嚴(yán)

4、重程度，其中以山茱萸環(huán)烯醚萜總苷+多糖小劑量組效果最佳。結(jié)論：環(huán)烯醚萜總苷+多糖為山茱萸防治DN的最佳活性部位群。
　　 第三部分山茱萸活性部位群對(duì)DN大鼠的作用及其機(jī)理研究
　　 一、山茱萸活性部位群對(duì)DN大鼠的作用研究
　　 (一)對(duì)DN大鼠體重、血糖及糖化血紅蛋白的影響
　　 目的：觀察山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎病大鼠體重、血糖及糖化血紅蛋白的影響。方法：雄性SD大鼠，禁食12小時(shí)后，一次性腹腔注射

5、STZ(鏈脲佐菌素)70mg·kg-1，3小時(shí)后恢復(fù)飲食。1周后測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、山茱萸活性部位群小、中、大劑量組。同期另設(shè)一正常組，每日灌胃給藥一次，各組連續(xù)給藥8周。測(cè)定大鼠給藥后第2、4、8周體重、給藥后第4、8周大鼠血糖以及給藥后第8周糖化血紅蛋白，動(dòng)態(tài)觀察糖尿病腎病大鼠的演變及山茱萸活性部位群的防治作用。結(jié)果：DN模型組大鼠的體重明顯降低，血糖和

6、糖化血紅蛋白水平明顯增加，與正常組比較有顯著差異(P<0.05，0.01)；經(jīng)山茱萸活性部位群治療后，DN大鼠的體重下降輕微減慢，血糖及糖化血紅蛋白有較明顯的下降，與模型組比較差異顯著(P<0.05，0.01)。結(jié)論：山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎臟病變具有一定的防治作用，抑制ACEs的生成可能是其作用途徑之一。
　　 (二)對(duì)DN大鼠血清胰島素及其敏感指數(shù)、C肽的影響
　　 目的：觀察山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎病大鼠血清胰

7、島素及其敏感指數(shù)、血清C肽含量的影響。方法：雄性SD大鼠，禁食12小時(shí)后，一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)70mg·kg-1，3小時(shí)后恢復(fù)飲食。1周后測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、山茱萸活性部位群小、中、大劑量組。同期另設(shè)一正常組，每日灌胃給藥一次，各組連續(xù)給藥8周。于給藥后第8周測(cè)定大鼠血清胰島素、c肽，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)，觀察山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎病的防治

8、作用。結(jié)論：山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎臟病變具有一定的防治作用。
　　 (三)對(duì)DN大鼠腎功能的影響
　　 目的：觀察山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能的影響。方法：雄性SD大鼠，禁食12小時(shí)后，一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)70mg·kg-1，3小時(shí)后恢復(fù)飲食。1周后測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值隨機(jī)分為模型對(duì)照組、卡托普利組、山茱萸活性部位群小、中、大劑量組。同期另設(shè)

9、—正常組，每日灌胃給藥一次，各組連續(xù)給藥8周。于給藥后第8周，測(cè)定血肌酐、尿肌酐、尿微量白蛋白的含量，并計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取雙腎去掉包膜稱(chēng)重并計(jì)算腎指數(shù)。觀察糖尿病大鼠的腎臟損傷情況及山茱萸活性部位群的防治作用。結(jié)論：山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟具有保護(hù)作用，能延緩其病理學(xué)進(jìn)展。
　　 (四)對(duì)DN大鼠胸主動(dòng)脈、腎組織形態(tài)學(xué)的影響
　　 目的：從形態(tài)學(xué)的角度探討山茱萸活性部位群是否具有防治實(shí)驗(yàn)性糖尿

10、病腎病的作用。方法：雄性SD大鼠，禁食12小時(shí)后，一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)70mg·kg-1，3小時(shí)后恢復(fù)飲食。1周后測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、山茱萸活性部位群小、中、大劑量組。同期另設(shè)一正常組，每日灌胃給藥一次，各組連續(xù)給藥8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用光鏡觀察腎組織及胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)改變等。結(jié)論：從山茱萸活性部位群能保護(hù)糖尿病腎病大鼠腎臟等組織形態(tài)學(xué)病理

11、改變，我們推斷山茱萸活性部位群能有效防治糖尿病腎病。
　　 二、山茱萸活性部位群對(duì)DN大鼠的作用機(jī)理研究
　　 (一)對(duì)DN大鼠血清脂質(zhì)的影響
　　 目的：通過(guò)對(duì)大鼠血清總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度酯蛋白(HDL-C)及低密度酯蛋白(LDL-C)的測(cè)定，初步探討脂質(zhì)代謝紊亂對(duì)由STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠的影響及山茱萸活性部位群的保護(hù)作用。方法：雄性SD大鼠，禁食12小時(shí)后，一次性腹腔注射STZ(

12、鏈脲佐菌素)70mg·kg-1，3小時(shí)后恢復(fù)飲食。1周后測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、山茱萸活性部位群小、中、大劑量組。同期另設(shè)—正常組，每日灌胃給藥一次，各組連續(xù)給藥8周。給藥8周后，采用試劑盒測(cè)定CHOL、TG、HDL-C及LDL-C的含量。結(jié)論：山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用可能與其改善脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。
　　 (二)對(duì)DN大鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響

13、
　　 目的：通過(guò)DN大鼠腎組織中T-AOC、MDA值的變化分析，初步探討由STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型的氧化應(yīng)激現(xiàn)象，以及山茱萸活性部位群保護(hù)腎臟作用機(jī)制。方法：雄性SD大鼠，禁食12小時(shí)后，一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)70mg·kg-1，3小時(shí)后恢復(fù)飲食。1周后測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、山茱萸活性部位群小、中、大劑量組。同期另設(shè)一正常組，每日灌

14、胃給藥一次，各組連續(xù)給藥8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)腎組織中T-AOC、MDA的活性。結(jié)論：氧化應(yīng)激參與了糖尿病。腎病得發(fā)病過(guò)程，山茱萸活性部位群對(duì)DN的治療作用部分是通過(guò)抗氧化實(shí)現(xiàn)的。
　　 (三)對(duì)DN大鼠血清NO、NOS和血漿ET、TXB2的影響
　　 目的：探討山茱萸活性部位群對(duì)NO、NOS、ET、TXB2的影響，以了解其對(duì)糖尿病腎病大鼠的作用及其作用機(jī)理。方法：雄性SD大鼠，禁食12小時(shí)后，一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐

15、菌素)70mg·kg-1，3小時(shí)后恢復(fù)飲食。1周后測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、山茱萸活性部位群小、中、大劑量組。同期另設(shè)一溶媒對(duì)照組，每日灌胃給藥一次，各組連續(xù)給藥8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血，測(cè)定大鼠血清NO、NOS、血漿ET及血栓素TXB2。結(jié)論：山茱萸活性部位群可部分恢復(fù)NO和ET的動(dòng)態(tài)平衡及血漿TXB2水平，對(duì)糖尿病大鼠腎臟病變有一定的保護(hù)作用。
　　 (四

16、)對(duì)DN大鼠紅細(xì)胞膜上Ca2+-ATP酶的影響
　　 目的：觀察山茱萸活性部位群對(duì)糖尿病腎病大鼠紅細(xì)胞膜上Ca2+-ATP酶活性的作用。方法：雄性sD大鼠，禁食12小時(shí)后，一次性腹腔注射STZ(鏈脲佐菌素)70mg·kg-1，3小時(shí)后恢復(fù)飲食。1周后測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7mM者則納入為糖尿病大鼠，并按血糖值隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、山茱萸活性部位群小、中、大劑量組。同期另設(shè)一正常組，每日灌胃給藥一次，各組連續(xù)給藥

17、8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用ATP酶試劑盒及考馬斯亮蘭蛋白試劑盒測(cè)定糖尿病大鼠紅細(xì)胞膜上Ca2+-ATP酶活性的改變。結(jié)論：山茱萸活性部位群可以通過(guò)改善紅細(xì)胞膜上Ca2-ATP酶活性對(duì)糖尿病時(shí)腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　 第四部分山茱萸活性部位群急性毒性試驗(yàn)
　　 目的：測(cè)定一日內(nèi)一次灌胃給予山茱萸活性部位群后小鼠及大鼠所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)和死亡情況。方法取禁食(不禁水)12小時(shí)的清潔級(jí)ICR小鼠和大鼠，雌雄各半。以最大濃度、最大容