吉西他濱衍生物Sl-01和吲唑芳基脲類化合物抗癌活性研究.pdf

1、研究背景：
　　 癌癥嚴重威脅人類健康，除手術治療外，化學治療仍然是腫瘤治療的主要手段。目前臨床廣泛應用的化療藥物除傳統的細胞毒類藥物外，單克隆抗體、小分子化合物抑制劑等靶向藥物越來越受到重視，并已經是目前及未來相當長時間內引領化療領域發(fā)展動向的主要研究方向。盡管如此，這些藥物仍然存在一定的毒副作用，并產生耐藥性，這可能是限制藥物成功化療的主要因素。為克服這些弱點，我們擬對細胞毒類藥物吉西他濱進行前體藥物修飾，對小分子靶向抑制劑

2、索拉非尼進行結構改造。
　　 吉西他濱以抗癌活性強、抗瘤譜廣的特點在化療藥物中占居重要地位，但其在血漿和肝臟中很快被滅活，且嚴重的毒副作用和耐藥性也限制其臨床應用。我們認為，對吉西他濱進行前藥修飾，在胞啶環(huán)的N4位引入具有長側鏈酯基酰胺基團，在一定程度上可以增加胃腸道吸收，阻斷脫氧胞苷脫氨酶的脫氨作用，增強代謝穩(wěn)定性，延長半衰期，提高生物利用度，從而達到增加抗癌活性，降低毒副作用的目的。我們從此系列化合物中篩選得到了SL-01(

3、N4-(3-正十二烷氧基甲?；拎?2-甲?；?-2’-脫氧-2’，2’-二氟胞苷），發(fā)現其具有較高的抗癌活性。本論文第一部分重點評價了化合物SL-01的抗腫瘤活性并對其作用機制進行初步探討。
　　 首個口服多激酶抑制劑索拉非尼是化療藥物中比較成功的雙芳基脲類化合物，但毒副作用以及易產生耐藥性也是其臨床應用所不可忽視的。根據索拉非尼的結構特點，我們設計合成了一系列基于吲唑或氮雜吲唑的雙芳基脲類或硫脲類化合物，初步試驗顯示出較好的

4、抑制腫瘤細胞增殖的活性。本論文的第二部分對初步篩選得到的15個化合物的體外抗腫瘤活性進行了進一步的篩選，對篩選出的化合物1082-39（N-{4-[1-（4-溴吲唑）]苯基}-N’-[4-氯-3-三氟甲基苯基]脲），探討其對人黑色素瘤M21體外抗癌活性和作用機制。
　　 第一部分吉西他濱口服衍生物SL-01的抗癌活性研究
　　 實驗目的:比較評價化合物SL-01與吉西他濱的抗腫瘤活性，初步探討SL-01的抗癌作用機制。<

5、br>　　 實驗方法:選用人非小細胞肺癌細胞NCI-H460和人結腸癌細胞HCT-116，以MTT法檢測了SL-01對癌細胞增殖的抑制作用，Hochest33258染色法和流式細胞術AnnexinV-FITC/PI雙染實驗測定了SL-01對癌細胞凋亡誘導作用;體內實驗，通過建立裸鼠移植NCI-H460和HCT-116腫瘤模型，檢測了SL-01對NCI-H460和HCT-116腫瘤細胞生長的抑制作用，進一步以TUNEL法檢測了SL-01

6、誘導腫瘤細胞凋亡率，westernblotting法檢測了SL-01對腫瘤組織caspase-9、caspase3、PARP、Bax和Bcl-2的調控作用。
　　 實驗結果:SL-01(0.156-20μM)與NCI-H460和HCT-116細胞分別孵育24h，48h，72h，SL-01以時間和劑量依賴性方式，顯著抑制癌細胞增殖;相同劑量下SL-01與吉西他濱對癌細胞的體外抑制活性相似。以8μMSL-01和吉西他濱分別處理細胞2

7、4h，Hoehest33258染色，可見細胞核染色質固縮濃染、或集聚至核膜周邊、或出現碎裂呈珠串狀等典型凋亡現象。FITC-AnnexinV/PI雙染結果顯示，SL-01明顯誘導細胞凋亡，8μM的SL-01作用24h，誘導NCI-H460和HCT-116細胞凋亡率分別為39.6％和41.4％，高于相同劑量下吉西他濱的凋亡活性(NCI-H460:27.8％，HCT-116:24.6％)。裸鼠實驗表明，口服給予SL-01(10、20、30μ

8、mol/kg，三天一次)三周，可明顯抑制NCI-H460和HCT-116腫瘤生長，抑制率分別為31.8％、43.1％、58.0％和36.4％、45.8％、63.1％，且對裸鼠體重影響不甚明顯;靜脈注射給予同劑量吉西他濱(30μmol/kg，三天一次)對NCI-H460和HCT-116腫瘤生長的抑制率分別是41.5％和46.9％，但動物體重下降較明顯。對腫瘤組織進行TUNEL分析，顯示SL-01處理組(10、20、30μmol/kg)腫瘤

9、組織中TUNEL陽染率明顯增高，NCI-H460和HCT-116組織中TUNEL陽染率分別為25.6％、41.7％、54.3％和20.7％、33.6％、47.7％，吉西他濱處理的NCI-H460和HCT-116組織中陽染率則分別為37.2％和31.2％。Westernblotting實驗發(fā)現，SL-01對腫瘤組織caspase-9、caspase3和PARP裂解活化程度及對Bax/Bcl-2上調作用均明顯高于吉西他濱。
　　 實

10、驗結論:SL-01對NCI-H460和HCT-116細胞的體外增殖抑制作用與吉西他濱相似，但對裸鼠接種的人癌細胞生長抑制作用明顯優(yōu)于吉西他濱。SL-01的抗癌活性與其誘導凋亡作用有關，符合caspase依賴性凋亡誘導作用機制。
　　 第二部分吲唑雙芳基脲類化合物的抗癌活性研究
　　 第一節(jié)吲唑雙芳基脲類化合物抗癌活性篩選實驗（體外實驗）
　　 實驗目的:對新設計的15個基于吲唑或氮雜吲唑的雙芳基脲類或硫脲類化合物

11、篩選，初步評價篩選出的5個化合物對血管生成的抑制作用和對黑色素瘤細胞M21增殖的抑制作用。
　　 實驗方法:采用MTT法，檢測了1121-39等15個雙芳基脲類化合物對人腫瘤細胞MDA-MB-231、PLC/PRF/5、HCT-116、786-O、NCI-H460生長的抑制作用;化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39對人黑色素瘤細胞M21及人臍靜脈內皮細胞HUVEC和EA.hy926

12、生長抑制作用;利用劃痕損傷法，檢測化合物1121-39、1122-38和1082-39對HUVEC細胞遷移能力的影響;以斑馬魚胚胎模型法，檢測化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39對血管生成的影響。
　　 實驗結果:結果顯示，除化合物1121-43、1122-26、1121-40外，新合成的其他化合物與MDA-MB-231、PLC/PRF/5、HCT-116和NCI-H460細胞分別

13、孵育72h，其IC50值多低于索拉非尼，而對于786-O細胞，只有1122-38、1082-39、1122-37、1104-40和1106-78的IC50值小于索拉非尼。篩選出的化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39與EA-hy-926細胞作用72h，其IC50值遠低于索拉非尼;而對于HUVEC細胞，只有化合物1121-39的IC50值為4.81±1.97μM;對于M21細胞，化合物1122

14、-38和1082-39作用72h的IC50值遠低于索拉非尼，1122-10和1122-37的IC50值與索拉非尼相當，而1121-39對M21細胞增殖無明顯抑制作用。劃痕實驗顯示，化合物1121-39、1122-38和1082-39能抑制HUVEC細胞遷移作用，以5μM作用24h，對HUVEC的遷移抑制率分別為23.16％、41.32％和45.63％，明顯低于相同劑量下的索拉非尼的抑制率71.85％。斑馬魚胚胎模型顯示，陽性對照藥物索拉

15、非尼顯著抑制斑馬魚胚胎體節(jié)間血管形成，致血流停滯和不同程度心囊水腫，循環(huán)系統障礙，而化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39對斑馬魚胚胎體節(jié)間的血管生成無明顯影響，未見血流異常等現象。
　　 實驗結論:篩選獲得到的吲唑雙芳基脲類化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39，體外對多種人癌細胞的增殖有明顯抑制作用，且活性優(yōu)于索拉非尼，但對斑馬魚胚胎

16、血管生成沒有影響。
　　 第二節(jié)化合物1082-39體外抗腫瘤活性研究及其機制探討
　　 實驗目的:比較評價化合物1082-39和索拉非尼對人黑色素瘤M21的抗癌活性，探討1082-39的抗癌作用機制。
　　 實驗方法:采用MTT法，測定了化合物1082-39和索拉非尼對人黑色素瘤細胞M21作用24、48、72h的半數抑制率。以流式細胞術AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測了1082-39與M21細胞孵育4

17、8h后的凋亡誘導作用。采用JC-1染色法，觀察了不同濃度1082-39作用48h，對M21線粒體膜電位的影響。提取M21細胞總蛋白，以western-blotting法檢測了M21細胞受體c-Kit表達水平，檢測了1082-39作用48h對M21細胞增殖核抗原PCNA，caspase-9、caspase3、PARP、Bax、Bcl-2、Mcl-1等凋亡相關蛋白、Akt及相關信號NF-κB、mTOR、GSK3β、c-Myc、survivi

18、n、PI3K、EGFR、Wnt2表達水平的影響;分別分離提取線粒體蛋白及核蛋白，采用western-blotting法檢測了1082-39對M21細胞色素c的重新分布及β-catenin入核的影響。
　　 實驗結果:化合物1082-39與M21細胞分別孵育24、48、72h，其IC50值均明顯低于索拉非尼，以72h最為明顯。流式細胞術顯示，1082-39明顯引起M21細胞凋亡，作用48h后，其5μM組凋亡率40.73％，高于同劑

19、量索拉非尼的凋亡率25.26％。以0、0.625、1.25、2.5、5μM的1082-39處理細胞48h，JC-1染色為紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強，綠色與紅色熒光光密度比值增加，最高組為2.71±0.2，高于索拉非尼組的光密度值之比（2.13±0.6）。Westernblotting結果顯示，與細胞孵育48h，1082-39比索拉非尼明顯下調M21細胞中PCNA表達量;1082-39顯著上調Bax表達，下調Mcl-1表達，而索拉

20、非尼則引起Mcl-1表達量明顯下調，但對Bax和Bcl-2表達影響較弱，二者均能上調Bax/Bcl-2，Bax/Mcl-1值，引起細胞色素c由線粒體到胞漿重新分布;對于凋亡執(zhí)行蛋白，1082-39可以明顯促進casepase-9和casepase-3裂解活化，PARP裂解增加，而索拉非尼對casepase-9和casepase-3活化作用較弱;Westernblotting結果顯示，M21細胞中無受體c-Kit表達，但1082-39與索