轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)下的氣道上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的信號(hào)機(jī)制以及中藥天龍喘咳靈的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究目的：氣道上皮損傷、脫落及上皮下纖維化是哮喘氣道重塑重要的病理特征。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者氣道壁網(wǎng)狀基底膜中肌纖維母細(xì)胞(myofibroblast)數(shù)量是增多的，其數(shù)量與基底膜的增厚相關(guān)。肌纖維母細(xì)胞有很強(qiáng)的分泌膠原和胞外基質(zhì)的能力，其因特征性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)從而具有對(duì)環(huán)境刺激產(chǎn)生收縮反應(yīng)的能力，但其細(xì)胞來(lái)源尚不清楚，我們推測(cè)：氣道上皮細(xì)胞在氣道炎癥微環(huán)境因素作用下有可能向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而參與了氣道高反應(yīng)的發(fā)

2、生。本研究旨在探討氣道上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)下向肌纖維母細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的可能性，以及與轉(zhuǎn)分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；探討中藥方劑天龍喘咳靈對(duì)肌纖維母細(xì)胞活化的標(biāo)志-α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響，及其信號(hào)分子機(jī)制，為拓展其在臨床的應(yīng)用以及開(kāi)發(fā)以其有效組分為基礎(chǔ)的新型藥物奠定基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容與方法：第一部分：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1體外誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的可能性1.觀(guān)察TGF-β1對(duì)氣道上皮細(xì)胞形態(tài)

3、、細(xì)胞表型標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-SMA及細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的影響。 2.RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞Ⅰ型膠原和纖維結(jié)合素(Fibronectin)mRNA的表達(dá)。 3.觀(guān)察TGF-β1對(duì)α-SMA啟動(dòng)子活化的影響。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pSMP8質(zhì)粒(包含小鼠α-SM啟動(dòng)子序列和其下游的氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)告基因)，ELISA法檢測(cè)CAT活性，觀(guān)察TGF-β1對(duì)α-SMA啟動(dòng)子活化的影響。 第

4、二部分：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制1.觀(guān)察TGF-β1對(duì)氣道上皮細(xì)胞內(nèi)smad2、smad3及p38MAPK、ERK1/2和JNK活化的影響。 2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染smad7表達(dá)載體，觀(guān)察其對(duì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化標(biāo)志α-SMA表達(dá)的影響。 3.觀(guān)察p38MAPK、ERK1/2和JNK絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)特異性抑制劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。

5、 4.觀(guān)察p38MAPK、ERK1/2和JNK絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)特異性抑制劑對(duì)氣道上皮細(xì)胞內(nèi)smad2和smad3活化的影響。 第三部分中藥天龍喘咳靈對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制1.觀(guān)察中藥(天龍喘咳靈、青天葵、淡附子和法夏)對(duì)氣道成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響。 2.觀(guān)察中藥(天龍喘咳靈、青天葵、淡附子和法夏)對(duì)氣道成纖維細(xì)胞內(nèi)p38MAPK、ERK1/2和smad2活化的影響。

6、 分別加入天龍喘咳靈、青天葵、淡附子和法夏預(yù)孵育2小時(shí)，再加入TGF-β1處理10min和30min，提取總蛋白，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38MAPK、ERK1/2和smad2的蛋白表達(dá)。 結(jié)果：第一部分：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1體外誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化1.正常16HBE-14o細(xì)胞未加刺激劑培養(yǎng)3天后，形成融合的單層細(xì)胞，形態(tài)呈立方形或小鵝卵石形，胞間連接緊密，具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣特征；加入TGF-β110μg/L

7、作用3天后，部分細(xì)胞肥大，拉長(zhǎng)呈梭形，細(xì)胞間隙增大，喪失其原有鋪路石樣生長(zhǎng)方式。 2.正常對(duì)照組16HBE-14o表達(dá)微量的α-SMAmRNA，加入TGF-β1刺激48小時(shí)后α-SMAmRNA表達(dá)量增加，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。而E-cadherinmRNA表達(dá)量隨著TGF-β1刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。 3.上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin在正常16HBE-14o細(xì)胞表

8、達(dá)強(qiáng)，定位在胞間連接處，而TGF-β1刺激3天后E-cadherin表達(dá)減弱，且彌散至胞漿內(nèi)。正常16HBE-14o細(xì)胞不表達(dá)肌纖維母細(xì)胞的表型標(biāo)志物α-SMA，而TGF-β1刺激2天后部分細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)α-SMA表達(dá)并集合成微絲狀。正常16HBE-14o細(xì)胞F-actin表達(dá)在細(xì)胞邊緣，在外圍形成環(huán)狀帶，而TGF-β1組F-actin定位改變且重新聚合形成張力纖維(stressfibers)沿著細(xì)胞長(zhǎng)軸分布。 第二部分：轉(zhuǎn)化生

9、長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制1.正常對(duì)照組核內(nèi)無(wú)磷酸化Smad2表達(dá)，smad3有微弱表達(dá)，TGF-β1刺激30min時(shí)表達(dá)量明顯增加，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量進(jìn)一步增加。 2.TGF-β1刺激24h時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染smad7組α-SMA表達(dá)量低于相應(yīng)轉(zhuǎn)染空載體組，E-cadherin表達(dá)量明顯高于相應(yīng)轉(zhuǎn)染空載體組，TGF-β1刺激36h后smad7組α-SMA、E-cadherin表達(dá)量與相應(yīng)空載

10、體組相似。 3.免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染smad7組α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于空載體組(P＜0.05)。 4.正常對(duì)照組磷酸化p38及Erk1/2僅有微弱表達(dá)，TGF-β1刺激5min時(shí)表達(dá)量明顯增加，刺激15min、30min和1h時(shí)表達(dá)量稍有下降但仍高于正常組，24h后表達(dá)量恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。正常對(duì)照組與TGF-β1刺激組都有極微弱的Phospho-JNK表達(dá)，表達(dá)量無(wú)顯著性差別。 5.加入p38MAPK和ERK1/

11、2特異性抑制劑組，絕大多數(shù)細(xì)胞F-actin和E-cadherin的表達(dá)恢復(fù)定位在細(xì)胞邊緣的正常氣道上皮細(xì)胞的特征，表達(dá)α-SMA的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)；而JNK特異性抑制劑組較之TGF-β1刺激組無(wú)明顯改變。 6.免疫印跡顯示：TGF-β1處理30min和24h，胞內(nèi)磷酸化smad2和核內(nèi)smad3的表達(dá)在p38MAPK、ERK1/2和JNK絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)特異性抑制劑組與單純TGF-β1刺激組比

12、較無(wú)明顯差異。 第三部分：中藥天龍喘咳靈對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制1.RT-PCR和western免疫印跡結(jié)果顯示：?jiǎn)渭僒GF-β1刺激增強(qiáng)了氣道上皮下成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA，天龍喘咳靈組和淡附子組α-SMAmRNA和蛋白的表達(dá)量均較單純TGF-β1組減少(P＜0.05)，其中天龍喘咳靈組α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)量的減少程度較淡附子組明顯。青天葵和法夏兩組與單純TGF-β1組比較無(wú)明顯差異(P＞0.0

13、5)。 2.免疫印跡相應(yīng)于RT-PCR的結(jié)果，天龍喘咳靈組和淡附子組磷酸化ERK1/2的表達(dá)明顯低于單純TGF-β1刺激組，而青天葵和法夏兩組與單純TGF-β1組相似。相比之下，未發(fā)現(xiàn)各藥物處理組對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的磷酸化p38和磷酸化smad2的表達(dá)具有明顯影響。 結(jié)論：1.氣道上皮細(xì)胞在TGF-β1的持續(xù)刺激下能夠向表達(dá)α-SMA的肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，這可能作為上皮下肌纖維母細(xì)胞的一個(gè)新的來(lái)源，從而參與哮喘氣道重塑、

14、氣道高反應(yīng)性的發(fā)生發(fā)展。 2.smads信號(hào)通路和MAPKs信號(hào)通路均參與了TGF-β1誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程。二者可能是相對(duì)獨(dú)立，互相平行的，激活MAPK通路可獨(dú)立誘導(dǎo)α-SMA的表達(dá)，并不需要間接通過(guò)經(jīng)典的samds通路介導(dǎo)。 3.天龍喘咳靈通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK1/2的水平來(lái)下調(diào)α-SMA表達(dá)，從而干預(yù)上皮下成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程，減少具有收縮反應(yīng)性的氣道肌纖維母細(xì)胞的數(shù)量，降低氣道高反應(yīng)性