枝孢樣枝孢霉微生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、枝孢樣枝孢霉是一種廣泛存在于環(huán)境中的暗色真菌，在一定條件下可導(dǎo)致人和動(dòng)物的暗色絲孢霉病。迄今為止，人類不但對(duì)枝孢樣枝孢霉的基本微生物學(xué)特性及其致病情況尚缺乏了解，而且還不得不面臨著對(duì)枝孢樣枝孢霉所致暗色絲孢霉病診斷和治療上的困難性與復(fù)雜性。因此，研究并評(píng)價(jià)枝孢樣枝孢霉的致病性、溫度耐受性、藥物敏感性以及其基因多態(tài)性等諸多微生物學(xué)特性，將對(duì)于枝孢樣枝孢霉所致暗色絲孢霉病的診斷、治療及其預(yù)后具有重要的理論意義及實(shí)際價(jià)值。 目的：

2、 探討枝孢樣枝孢霉的致病性；觀察并比較枝孢樣枝孢霉與卡氏枝孢霉超微結(jié)構(gòu)的差異，探討其可能的致病性差異；檢測(cè)枝孢樣枝孢霉對(duì)8種常用抗真菌藥物的敏感性，為治療枝孢樣枝孢霉感染提供抗真菌藥物的參考依據(jù)；觀察并比較枝孢樣枝孢霉與幾種常見致病性暗色真菌(裴氏著色真菌、緊密著色真菌、疣狀瓶霉、卡氏支孢霉、皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉、鏈格孢)的耐熱性，探討溫?zé)嶂委煹谋匾约翱尚行?；研究枝孢樣枝孢霉及常見致病性暗色真菌基因多態(tài)性，初步了解它們?cè)谕瑢賰?nèi)及

3、同種內(nèi)，屬間及種間的基因遺傳相似性及遺傳變異性；枝孢樣枝孢霉及常見致病性暗色真菌蛋白組學(xué)比較研究，以了解枝孢樣枝孢霉與常見致病性暗色真菌蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。 方法與結(jié)果： (1)枝孢樣枝孢霉對(duì)小鼠的致病性：將枝孢樣枝孢霉的菌懸液分別接種于正常和免疫抑制小鼠的腹側(cè)皮膚，于接種后的第15、30、60天處死動(dòng)物，取接種部位的皮膚組織和各臟器組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查和逆培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在皮膚接種部位均出現(xiàn)不同程度損害。并且隨著時(shí)間推

4、移，損害加重。損害部位皮膚組織逆培養(yǎng)均陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)小鼠均未見系統(tǒng)播散。 (2)將枝孢樣枝孢霉與卡氏枝孢霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在光學(xué)顯微鏡和透射電鏡下對(duì)臨床分離的枝孢樣枝孢霉與卡氏枝孢霉的形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究。受試的兩種真菌在超微結(jié)構(gòu)上有一定差異，枝孢樣枝孢霉易于發(fā)生衰老，其真菌細(xì)胞壁可出現(xiàn)顯著增厚等改變。 (3)枝孢樣枝孢霉的抗真菌藥物的敏感性試驗(yàn)：參照美國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的產(chǎn)

5、孢絲狀真菌試驗(yàn)方案(M27-A)和(M38-P)。微量稀釋法進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定，所選菌懸液終濃度為(0.4～5)×106cfu/mL，孵育溫度35℃，培養(yǎng)時(shí)間5～7d。測(cè)定枝孢樣枝孢霉對(duì)氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬、酮康唑、咪康唑、聯(lián)苯芐唑、益康唑、制霉菌素的最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果顯示，枝孢樣枝孢霉對(duì)伊曲康唑、特比萘芬、酮康唑、咪康唑、聯(lián)苯芐唑、益康唑、制霉菌素的敏感性均較高，而對(duì)氟康唑敏感性較差。 (4)真菌耐

6、熱試驗(yàn)：所選擇的實(shí)驗(yàn)溫度分別為37℃、45℃和55℃。隨機(jī)取各種菌液3管及安置溫度計(jì)的生理鹽水試管同時(shí)固定于水浴鍋內(nèi)，待生理鹽水試管的溫度達(dá)到實(shí)驗(yàn)溫度時(shí)，分別計(jì)時(shí)10min、30min、60min時(shí)，立即取出菌液并將其接種于裝有沙氏培養(yǎng)基的平皿中央并觀察生長(zhǎng)情況。受試菌種的菌懸液經(jīng)37℃、45℃不同時(shí)間處理后，再培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況未受影響，55℃處理后除皮炎外瓶霉、鏈格孢外其余菌種(包括枝孢樣枝孢霉)在55℃不同時(shí)間處理后生長(zhǎng)均受不同程度影

7、響。而枝孢樣枝孢霉、卡氏支孢霉、甄氏外瓶霉培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)即不生長(zhǎng)，皮炎外瓶霉在42℃培養(yǎng)時(shí)即不生長(zhǎng)，不同于其它菌株。 (5)隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析：應(yīng)用GenTLETMDNA提取試劑盒提取菌絲體DNA，以隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)法對(duì)18株暗色真菌的DNA指紋圖譜進(jìn)行分析。共選用10個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出3個(gè)具有穩(wěn)定、清晰DNA擴(kuò)增帶型的引物，即引物1:5’-GAGCCCTCCA-3’，引物4:5’-GTCAGGGCAA-3’

8、和引物5:5’-CAGCACCCAC-3’。18株菌DNA帶型不完全相同，有一定的種間和種內(nèi)的遺傳變異性和遺傳相似性腐生菌枝孢樣枝孢霉與其他部分暗色真菌位于同一樹組中。同種菌并不都具有遺傳相似性。 (6)雙向電泳技術(shù)及蛋白質(zhì)譜分析：，蛋白質(zhì)首先根據(jù)其等電點(diǎn)在pH梯度膠內(nèi)等電聚焦，然后按照它們的相對(duì)分子量大小進(jìn)行SDS-PAGE第二次電泳分離，從而獲得二維的蛋白質(zhì)分離圖譜。結(jié)果表明枝孢樣枝孢霉的蛋白分離不易獲得清晰分離圖譜。

9、 結(jié)論： (1)枝孢樣枝孢霉對(duì)小鼠皮膚有較強(qiáng)的機(jī)會(huì)致病性。但對(duì)小鼠內(nèi)臟器官的機(jī)會(huì)致病性較弱。 (2)枝孢樣枝孢霉和卡氏枝孢霉的超微結(jié)構(gòu)有一定差異，枝孢樣枝孢霉易于發(fā)生衰老的現(xiàn)象在一定程度上提示其致病性要遜于卡氏枝孢霉。 (3)檢測(cè)枝孢樣枝孢霉對(duì)抗真菌藥物的敏感性是必要的和有價(jià)值的，但體外試驗(yàn)僅可作為體內(nèi)治療選藥的參考。 (4)并非所有暗色真菌經(jīng)45℃或55℃處理后生長(zhǎng)均被完全殺滅，部分暗色真菌僅表現(xiàn)為受

10、到抑制。對(duì)局部熱療的適宜溫度和作用形式因菌種不同而有差異。局部熱療與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)治療暗色真菌病是有益的。 (5)隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析表明，包括枝孢樣枝孢霉在內(nèi)的暗色真菌在屬內(nèi)各種間不一定有遺傳相似性；但腐生菌與致病菌的DNA帶型未見明顯特征性差異，似乎還有一定遺傳相似性。 (6)枝孢樣枝孢霉的蛋白分離困難，不易獲得清晰的蛋白質(zhì)分離圖譜，這可能與超微結(jié)構(gòu)所見枝孢樣枝孢霉的真菌細(xì)胞壁明顯增厚有關(guān)。僅培養(yǎng)條件的改變