成人社區(qū)獲得性肺炎的病毒病原學(xué)及臨床特征分析.pdf

1、第一部分：常見呼吸道病毒快速細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定體系的建立
　　 背景：病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有病毒分離培養(yǎng)、病毒核酸分子生物學(xué)檢測、病毒直接檢查、血清學(xué)試驗(yàn)檢測病毒特異性抗體等。在國外發(fā)達(dá)國家的臨床實(shí)驗(yàn)室，病毒檢測技術(shù)均比較成熟，但國內(nèi)病毒檢測技術(shù)普及程度低，全國的大型綜合醫(yī)院大多沒有常規(guī)進(jìn)行臨床呼吸道病毒檢測。少數(shù)開展病毒檢測的醫(yī)院，病毒檢測手段相對(duì)單一，較少應(yīng)用病毒診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”—病毒分離，多數(shù)僅應(yīng)用一至兩種病毒學(xué)檢測方法，如免

2、疫熒光（IF）檢測呼吸道分泌物中的病毒抗原、分子生物學(xué)技術(shù)檢測病毒核酸或血清學(xué)試驗(yàn)檢測病毒特異性IgM抗體等。建立多種病毒診斷方法，包括病毒分離，對(duì)呼吸道病毒感染的監(jiān)測和診斷具有重要的臨床意義。
　　 目的：改進(jìn)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，聯(lián)合直接IF檢測，建立常見呼吸道病毒快速細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定體系，并驗(yàn)證該體系的檢測敏感性、檢測時(shí)間和檢測通量。
　　 方法：采集廣東省中醫(yī)院急診科成人急性呼吸道感染（ARI）患者和深圳市兒童醫(yī)院兒童

3、ARI患者的鼻/咽拭子標(biāo)本，接種到狗腎細(xì)胞（MDCK）、恒河猴腎細(xì)胞（LLC-MK2）、人鼻咽癌細(xì)胞（Hep-2）三種細(xì)胞上，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。室溫3000rpm，離心60min后補(bǔ)加等體積的細(xì)胞維持培養(yǎng)液，置34℃、含5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周觀察細(xì)胞病變（CPE）3～4次，于標(biāo)本接種后36～48h及第5～7天，各吸取50μl MDCK及LLC-MK2培養(yǎng)上清做血凝試驗(yàn)（HAT）。CPE和/或HAT陽性者，以病毒特異性單克

4、隆熒光抗體[甲型流感病毒(Flu A)、乙型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、副流感病毒1、2、3型(PIV-1、2、3)]做IF鑒定。所有標(biāo)本接種后7天，對(duì)陰性細(xì)胞再做IF篩查，陰性者判為陰性，陽性者根據(jù)陽性細(xì)胞類型選擇對(duì)應(yīng)的病毒特異性抗體做IF鑒定。將ATCC標(biāo)準(zhǔn)病毒株，分別接種到對(duì)應(yīng)宿主細(xì)胞上，3～7天后刮取細(xì)胞作涂片固定后低溫保存，在IF時(shí)作為陽性對(duì)照。
　　 結(jié)果：①2009年1月至4

5、月期間，共檢測拭子標(biāo)本641份，病毒陽性87份，陽性率13.6％。檢出病毒88株（1份標(biāo)本為Flu A/B雙重感染），其中Flu-A 20株，F(xiàn)lu-B 39株，PIV-1 2株，PIV-2 1株，PIV-3 15株，ADV 8株，RSV 2株。②每塊96孔板可接種11份標(biāo)本，每批接種4塊96孔板較為合適，即接種44份標(biāo)本。③標(biāo)本接種后，出現(xiàn)陽性結(jié)果的平均時(shí)間分別為：Flu 2d、ADV 3d、PIV 3-4d，RSV 5d。
　

6、　 結(jié)論：本次實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)穩(wěn)定的呼吸道病毒快速細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定體系，敏感性好，特異性佳，每批可檢測44份標(biāo)本，得到陽性結(jié)果的平均時(shí)間約為2～5天，可應(yīng)用于常見呼吸道病毒分離檢測。
　　 第二部分：成人社區(qū)獲得性肺炎的病毒病原學(xué)及臨床特征分析
　　 背景：社區(qū)獲得性肺炎(CAP)是威脅人類健康的最常見感染性疾病之一。在我國，肺炎在所有死因中排第五位。然而，目前對(duì)CAP的病原學(xué)仍知之不足，大約有17％-48％的CAP患者病

7、原學(xué)不明。20世紀(jì)以來的幾次全球流行性急性呼吸道病毒感染性疾病，如20世紀(jì)的4次流感大流行、1997年最先報(bào)道于香港的人感染高致病性禽流感、2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）等均嚴(yán)重威脅著人類的健康。2009年爆發(fā)的全球甲型H1N1流感大流行，截止至2010年3月7日，已導(dǎo)致全球死亡16,713例，其中中國有796例，而未來的流行趨勢尚不明朗。我國華南地區(qū)因特殊的地理位置、海洋季風(fēng)氣候和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式，被國際學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為是“世界

8、流感中心”。2003年的SARS亦被認(rèn)為起源于廣東。而廣州市是我國華南地區(qū)的中心大城市，與國際及內(nèi)地其他城市接觸交流頻繁。近年來流行病學(xué)調(diào)查顯示病毒性肺炎的發(fā)病率高達(dá)56％，病毒已被公認(rèn)為是CAP的重要病原學(xué)之一，但是CAP診治指南并沒有提供詳細(xì)的有關(guān)病毒性肺炎的評(píng)估和治療建議。國內(nèi)目前尚缺乏成人病毒性CAP病原及臨床特征的詳細(xì)資料。
　　 目的：檢測成人CAP的病毒病原學(xué)，分析臨床特征。
　　 方法：收集2009年4月

9、至2009年12月期間，就診于廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的CAP患者的鼻/咽拭子、急性期與恢復(fù)期（2-4周后）血清，記錄病史資料。應(yīng)用常見呼吸道病毒快速細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定體系、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測鼻/咽拭子標(biāo)本，應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)（HI）、間接IF試驗(yàn)檢測急性期與恢復(fù)期血清中呼吸道病毒特異性IgG抗體滴度（4倍或以上升高為陽性）。呼吸道病毒快速細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定、RT-PCR或血清學(xué)試驗(yàn)任一項(xiàng)陽性則判斷為病毒感染。
　　

10、結(jié)果：①最終入選CAP病例149例，男性84例，女性65例，年齡中位數(shù)M（四分衛(wèi)間距IQR）為60(35～77)歲，鼻/咽拭子149份，70例有雙份血清。89例患者伴有慢性阻塞性肺疾病等慢性基礎(chǔ)疾病。②病毒檢測陽性48例，陽性率32.2％。不同年齡段人群，陽性率不同，以16～19歲的青少年（54.5％）及79歲以上的老年人（57.3％）最高，各年齡組的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023）。單一病毒感染44例（Flu A 24例，F(xiàn)l

11、u B 5例，ADV及PIV-1各2例，PIV-3 11例），雙重病毒感染4例。其中有1例Flu A和1例Flu A+ADV感染患者痰培養(yǎng)檢出大腸埃希菌，1例PIV-3感染患者痰培養(yǎng)檢出副流感嗜血桿菌。52株病毒中，快速細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定體系檢出18株病毒，RT-PCR檢出41株病毒，血清學(xué)試驗(yàn)檢出21株病毒。有雙份血清的70例患者中，與“金標(biāo)準(zhǔn)”病毒培養(yǎng)比較，RT-PCR法的檢測敏感性較高（P=0.003），特異性為80.7％，血清學(xué)試驗(yàn)

12、的檢測敏感性類似（P=0.118），特異性為75.4％，③48例病毒性肺炎患者，年齡M（IQR）為58（30～79）歲，男性27例，26例伴有基礎(chǔ)疾病。18.8％的病毒性肺炎患者發(fā)病前有發(fā)熱患者接觸史，與病毒檢測陰性的肺炎患者（9.9％）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.13）。④病毒性肺炎病例中，高熱≥39℃（66.7％）、乏力（64.6％）、咳膿痰（52.1％）、咽痛（45.8％）、呼吸困難（41.7％）、鼻部癥狀（41.7％）為最常

13、見的癥狀。Flu A及PIV-3感染患者可伴有咯血、胸悶胸痛。Flu及PIV-3感染患者呼吸困難及消化道癥狀亦多見。⑤48例病毒性肺炎患者，兩個(gè)或以上肺葉病變的比例達(dá)56.3％，有6例（12.5％）出現(xiàn)胸腔積液，與病毒檢測陰性肺炎患者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.384和0.371）。⑥病毒性肺炎患者中，CURB-65評(píng)分為中高危及有并發(fā)癥的比例（20.8％、66.7％），均有高于病毒檢測陰性患者的趨勢（13.9％、49.5％），但無統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、差異（P=0.177和0.063）。54.2％的病毒性肺炎患者需要吸氧，37.5％出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂，明顯高于病毒檢測陰性組（P=0.008和0.002）。病毒性肺炎患者中，有基礎(chǔ)疾病者的呼吸衰竭及腎功能損害等的發(fā)生率高于無基礎(chǔ)疾病者。
　　 結(jié)論：1.病毒是CAP的常見病原體之一，在本檢測范圍內(nèi)，最常見的病毒病原體是Flu A和PIV-3。2.不同病毒診斷方法的敏感性及適用范圍不同。3.根據(jù)臨床特征不能區(qū)分病毒性肺炎和非病毒性肺炎