CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢上皮性癌腹腔轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、目的：卵巢上皮性癌（簡(jiǎn)稱卵巢癌）是婦科腫瘤領(lǐng)域中最具有挑戰(zhàn)性的疾病，其死亡率居女性生殖道惡性腫瘤之首。卵巢癌高死亡率主要是因?yàn)樵摬≡诖_診時(shí)70％的患者是晚期，疾病的范圍已經(jīng)超過卵巢擴(kuò)散到腹腔和腹膜后淋巴結(jié)，而晚期卵巢癌的五年生存率則長(zhǎng)期徘徊在30％左右。與其他多種類型的癌不同，卵巢癌的主要轉(zhuǎn)移途徑不是通過血管，而是腹腔轉(zhuǎn)移。由于在腹腔的廣泛種植和轉(zhuǎn)移常常引起嚴(yán)重腹水和腸梗阻，所以卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移是直接引起患者死亡的主要原因。本課題擬通過

2、構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CXCR4卵巢癌細(xì)胞株及人腹膜間皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，到體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，最后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)這樣由淺入深，層次遞進(jìn)的模式來(lái)探討CXCL12-CXCR4生物軸在卵巢癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中的作用，從而更好的理解卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為抗卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移的治療尋找新的途徑。
　　 方法：
　　 1.穩(wěn)定表達(dá)CXCR4的卵巢癌細(xì)胞株的建立與鑒定及其增殖、遷移、侵襲能力的體外實(shí)驗(yàn)研究：首先將載體pReceiver-M02和目的基因CXCR

3、4連接構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果證實(shí)正確。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將高表達(dá)CXCR4的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4及載體pReceiver-M02分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3，經(jīng)G418篩選并且通過單細(xì)胞分離技術(shù)獲得了數(shù)個(gè)單細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR，Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定。將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染載體及未轉(zhuǎn)染的三種卵巢癌

4、細(xì)胞SKOV3進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，判斷在無(wú)牛血清培養(yǎng)液的生長(zhǎng)條件下，不同濃度的CXCL12對(duì)三種細(xì)胞增殖的影響以及CXCR4中和抗體和CXCR4拮抗劑AMD3100的抑制作用；以Transwell侵襲小室為模型，應(yīng)用Matrigel探討不同濃度的CXCL12對(duì)三種細(xì)胞遷移、侵襲的影響以及CXCR4中和抗體和CXCR4拮抗劑AMD3100的抑制作用。
　　 2.人腹膜間皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及其

5、對(duì)卵巢癌細(xì)胞黏附、遷移、侵襲力影響的體外實(shí)驗(yàn)研究：術(shù)中取無(wú)盆腹腔炎癥、正?；颊叩拇缶W(wǎng)膜。用0.25％胰酶+0.02％乙二胺四乙酸（EDTA）消化大網(wǎng)膜組織，去除紅細(xì)胞后培養(yǎng)；顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)算細(xì)胞純度；掃描電子顯微鏡（（SEM）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定；粘附、遷移、侵襲體外實(shí)驗(yàn)觀察腹膜間皮細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 3.荷人卵巢癌細(xì)胞裸鼠腹腔移植瘤模型的建立及實(shí)驗(yàn)研究：

6、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染載體和未轉(zhuǎn)染的三種卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。將裸鼠隨機(jī)分為三組，每組各12只，分別將4×106個(gè)三種細(xì)胞注入每組裸鼠腹腔，自注入細(xì)胞后第二天起，將每組裸鼠又隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組，對(duì)照組腹腔內(nèi)再注入生理鹽水，處理組腹腔內(nèi)再注入CXCR4拮抗劑AMD3100，同時(shí)每組均腹腔內(nèi)注射CXCL120.2ml，濃度為100ng/ml，每2天注射一次，連用2周共7次。裸鼠自然死亡后，觀察腹腔成瘤數(shù)、體積、腹水量和存活期的變化。
　

7、　 結(jié)果：
　　 1.穩(wěn)定表達(dá)CXCR4的卵巢癌細(xì)胞株的建立與鑒定及其增殖、遷移、侵襲能力的分析：①目的基因CXCR4與載體pReceiver-M02的連接成功構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4后，進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果證明順序正確，其序列與GeneBank中人CXCR4基因（NM003467）的標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致。②確定G418的篩選濃度為600μg/mL。③14 d后轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞絕大部分死亡形成細(xì)胞

8、島，經(jīng)有限稀釋法獲得了數(shù)個(gè)單細(xì)胞，將單細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。G418抗性篩選一個(gè)月后細(xì)胞仍繼續(xù)生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)速度未發(fā)生明顯變化，伸展速度較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞慢。④將獲得的穩(wěn)定表達(dá)CXCR4卵巢癌細(xì)胞株通過RT-PCR、Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)三種方法進(jìn)行鑒定，三種方法均表明CXCR4目的基因在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，選取的11個(gè)單細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，通過上述三種方法鑒定，結(jié)果8個(gè)單細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后有CXCR4的陽(yáng)性表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率平均為7

9、3％（8/11）。同時(shí)將轉(zhuǎn)染真核表達(dá)重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4和轉(zhuǎn)染載體pReceiver-M02的卵巢癌細(xì)胞分別命名為SKOV3/CXCR4和SKOV3/neg細(xì)胞。⑤MTT法觀察100ng/ml CXCL12單獨(dú)作用可促進(jìn)SKOV3/CXCR4細(xì)胞的增殖，且能被10μg/ml CXCR4中和抗體和1μg/ml CXCR4拮抗劑AMD3100所抑制，100ng/ml CXCL12加入SKOV3/neg和SKOV3細(xì)

10、胞中，增殖未發(fā)生明顯變化，表明CXCL12-CXCR4生物軸相互作用方可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。⑥在無(wú)血清條件下，10ng/ml CXCL12促進(jìn)SKOV3/CXCR4細(xì)胞的遷移；而100ng/ml CXCL12使遷移的細(xì)胞數(shù)明顯增多，表明CXCL12對(duì)SKOV3/CXCR4細(xì)胞的遷移有明顯的催化性，并隨CXCL12濃度的增加遷移細(xì)胞數(shù)增多；10μg/ml CXCR4中和抗體和1μg/ml和CXCR4的拮抗劑AMD3100能夠抑制100n

11、g/ml CXCL12對(duì)卵巢癌細(xì)胞的趨化性遷移。對(duì)于SKOV3/neg及SKOV3細(xì)胞，無(wú)論加入多大濃度的CXCL12都不能促進(jìn)細(xì)胞的遷移，進(jìn)一步表明CXCL12-CXCR4生物軸相互作用可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移，同時(shí)也表明CXCL12與CXCR4相互作用的相對(duì)特異性。⑦對(duì)于SKOV3/CXCR4細(xì)胞來(lái)說(shuō)，當(dāng)下室為無(wú)血清的培養(yǎng)液時(shí)，穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)很少（25.00±8.42），10ng/ml CXCL12作用后穿過Matrige

12、l的細(xì)胞數(shù)目增多，100ng/mlCXCL12刺激后，穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)明顯增多（56.00±9.23），兩者相比有顯著性差異，表明CXCL12對(duì)SKOV3/CXCR4細(xì)胞穿過Matrigel的侵襲性有趨化作用，并且隨著CXCL12濃度的增加穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)增多；10μg/ml CXCR4中和抗體和1μg/ml CXCR4拮抗劑AMD3100，能夠抑制CXCL12對(duì)卵巢癌細(xì)胞的趨化性侵襲；對(duì)于SKOV3/neg及S

13、KOV3細(xì)胞，無(wú)論加入多大濃度的CXCL12穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化，各組之間比較，無(wú)顯著性差異。
　　 2.人腹膜間皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞黏附、遷移和侵襲力影響的分析：①分離培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞為多角形，匯合時(shí)呈鋪路石樣排列，培養(yǎng)細(xì)胞的純度達(dá)95％以上。②SEM下見細(xì)胞表面大量的微絨毛。③免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示：細(xì)胞角蛋白、波形蛋白抗原陽(yáng)性，白細(xì)胞CD45、第Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性，鑒定符合腹膜間皮細(xì)胞的特點(diǎn)。

14、④氫化可的松（0.5％）、胰島素（20μg/ml）對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。⑤免疫細(xì)胞化學(xué)法證實(shí)腹膜間皮細(xì)胞中表達(dá)CXCL12、間皮素，不表達(dá)CXCR4。⑥黏附、遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)顯示腹膜間皮細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力有增強(qiáng)作用。
　　 3.CXCL12-CXCR4生物軸對(duì)荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響：①三組荷瘤裸鼠自然死亡后解剖腹腔顯示無(wú)論是對(duì)照組還是處理組，均在腹腔形成移植瘤，成瘤率100％。②各組裸鼠腹腔均有

15、腹水形成，部分有血性腹水，腹水量相比沒有顯著性差異。③所有裸鼠盆腔、腹腔、網(wǎng)膜、腸系膜、腹壁多處有腫瘤結(jié)節(jié)，部分有肝臟、脾臟、子宮雙附件轉(zhuǎn)移，心臟、腎臟、肺臟未見轉(zhuǎn)移。④三組裸鼠對(duì)照組的平均生存期相比有顯著性差異，接種SKOV3/CXCR4細(xì)胞裸鼠處理組的平均生存期長(zhǎng)于對(duì)照組，兩者相比具有顯著性差異。⑤將腹腔內(nèi)的移植瘤剪下，計(jì)數(shù)并稱取重量。接種SKOV3/CXCR4細(xì)胞裸鼠的對(duì)照組腹腔移植瘤的平均個(gè)數(shù)為87.67±1.86n，平均重量量

16、是3.74±0.11 g，CXCR4拮抗劑AMD3100治療組腹腔移植瘤的平均個(gè)數(shù)為80.17±4.58 n，平均重量是2.83±0.10 g，兩者相比具有顯著性差異；接種SKOV3/neg細(xì)胞裸鼠對(duì)照組腹腔內(nèi)移植瘤的平均個(gè)數(shù)為79.17±2.32 n，平均重量為2.82±0.13 g，CXCR4拮抗劑AMD3100治療組腹腔移植瘤的平均個(gè)數(shù)為79.83±3.25 n，平均重量為2.76±0.11 g，兩者相比無(wú)顯著性差異；接種SKOV

17、3細(xì)胞裸鼠對(duì)照組腹腔內(nèi)移植瘤的平均個(gè)數(shù)為78.16±1.17 n，平均重量為2.82±0.12 g，CXCR4拮抗劑AMD3100治療組腹腔移植瘤的平均個(gè)數(shù)為77.67±3.33 n，平均重量為2.84±0.11 g，兩者相比無(wú)顯著性差異；三組裸鼠對(duì)照組腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)和重量相比有顯著性的差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.穩(wěn)定表達(dá)CXCR4的卵巢癌細(xì)胞株構(gòu)建成功，并通過RT-PCR、Westernblot、免疫細(xì)胞化學(xué)三種

18、方法鑒定，CXCL12-CXCR4生物軸在體外細(xì)胞水平可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。
　　 2.胰酶+EDTA消化法是一種簡(jiǎn)單、有效的分離腹膜間皮細(xì)胞的方法。腹膜間皮細(xì)胞中表達(dá)CXCL12、間皮素，不表達(dá)CXCR4，腹膜間皮細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞黏附、遷移、侵襲有增強(qiáng)作用。
　　 3.荷人卵巢癌細(xì)胞裸鼠腹腔移植瘤模型建立成功，并在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)一步說(shuō)明CXCL12-CXCR4生物軸可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲能力。