通用探針實時熒光PCR檢測禽病毒病方法的研究.pdf

1、禽病毒性疾病是威脅養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的一類傳染病，由于實時熒光PCR技術(shù)是一種新型的核酸檢測技術(shù)，它從病毒的基因組著手對病毒進行檢測，在臨床診斷中已經(jīng)用于細菌、病毒及遺傳性疾病的檢測，具有極大的應用價值。本研究根據(jù)熒光PCR檢測原理，利用通用探針建立了禽病毒性疾病實時熒光PCR檢測方法。這一個研究方法不但摒棄了SYBRGreenI類熒光染料假陽性率高的弊端，而且具有快速、準確、高效的特性。本研究共分為三部分： 第一部分：新城疫病毒的分

2、離和鑒定為了研究我國近年來病毒性疾病的流行情況，擬對本實驗所涉及病毒做出分離和鑒定，但是由于時間有限，故只做了新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)的分離和鑒定工作。本部分采用雞胚尿囊腔培養(yǎng)，血凝(Hemagglutination，HA)和血凝抑制(Hemagglutinationinhibition，HI)，間接熒光抗體試驗(IFA)，RT-PCR/PCR試驗和基因芯片試驗對NDV進行了分離和鑒定。從全國七個

3、省市的9個雞場53只疑似患有新城疫病的雞中，分離到28株NDV野毒株，結(jié)果說明NDV在我國普遍存在，而且呈現(xiàn)蔓延的趨勢；同時試驗結(jié)果說明基因芯片方法要優(yōu)于其他三種檢測方法，具有高度的特異性和靈敏度。 第二部分：通用探針實時熒光PCR檢測禽病毒病方法的建立本部分首先構(gòu)建含有NDV特定片段的質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板進行了通用探針實時熒光PCR反應條件的優(yōu)化，然后以優(yōu)化好的通用探針實時熒光PCR條件對傳染性喉氣管炎病毒(Infecti

4、ousLaryngotracheitisViruse，ILT)、傳染性支氣管病毒((InfectiousBronchitisViruse，IBV)、傳染性法氏囊病病毒(InfectiousbursalDiseaseVriuse，IBDV)進行檢測試驗，并對本試驗方法進行了評估。 根據(jù)GenbankNDVmRNA全序列，設計了一對特異引物(UP1：5’-GCCAACATCCTCCGATTA-3’；DOWN：5'-AGTGATTTG

5、TGGTCCGAATCA-3’)。提取NDV種毒RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用上述一對引物進行PCR，純化產(chǎn)物與pMD18-TSimpleVector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM109，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定后，進行測序。結(jié)果表明該NDV特定片段克隆成功。 根據(jù)通用探針實時熒光PCR的探針和引物的設計要求設計出通用探針實時熒光PCR所使用的引物和探針，以構(gòu)建好的NDV的質(zhì)粒為模板，從熒光強度、引物濃度、Mg2

6、+的濃度、探針的濃度、Taq酶和Buffer的用量等方面對反應體系進行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果主要是將熒光強度的檢測放在了變性階段，增加了PCRBuffer的用量，減少了Mg2+的濃度。 以優(yōu)化好的通用探針實時熒光PCR的反應條件，分別對ILTV、IBDV、IBV進行了特異性檢測試驗，同時也進行了通用探針實時熒光PCR的靈敏度、重復性、陽性樣品的檢測試驗。試驗結(jié)果說明通用探針實時熒光PCR的具有高度的特異性和靈敏度，其檢驗方法可對10-

7、10雞胚半數(shù)致死量的病毒進行有效的檢測，靈敏度為普通PCR的1000～10000倍。 第三部分：通用探針實時熒PCR的初步應用利用優(yōu)化好的反應條件對來自山東各地不同雞場疑似患有新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)、傳染性喉氣管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitisViruse，ILT)、傳染性支氣管病毒((InfectiousBronchitisViruse，IBV)、傳染性法